化學(xué)發(fā)光法主要生產(chǎn)工藝

一、原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)�；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原或抗體上，或酶作用于發(fā)光底物。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，同時(shí)發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測(cè)物質(zhì)的量成正比，由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。

二、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型

（一）化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)，是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物(AE)。

（二）化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

從標(biāo)記免疫分析角度，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)，應(yīng)屬酶免疫分析，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免分析完全相同：以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)（如酶標(biāo)記的抗原或抗體）進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物。

（三）時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)

是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，如銪（Eu³⁺）、鋱（Te³⁺）及釤（Sm³⁺）、鏑（De³⁺）等代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質(zhì)、放射性同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，來標(biāo)記抗體、抗原、多肽、激素、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。

（四）電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)

是電化學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過程。ECL 反應(yīng)底物有兩種：三氯聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]²⁺、絡(luò)合物三丙胺(TPA)。

三、主要生產(chǎn)工藝（以微孔板載體的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析為例進(jìn)行描述）

（一）固相載體的制備

1．包被板的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被板，記錄批號(hào)、數(shù)目、狀態(tài)標(biāo)識(shí)。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：尺寸，外觀，包裝。

2．包被液的配制

配制包被緩沖液，加入包被的抗體或抗原至工作濃度，混合均勻，即成所需的包被液，工作濃度的包被液應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：包被緩沖液配方，pH值，包被物成份。

3．包被板的包被

包被液按工藝要求加入包被板。記錄所包被的包被板數(shù)量。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：包被體積，溫度，時(shí)間，過程監(jiān)控。

關(guān)鍵設(shè)備：包被機(jī)、精密天平、加樣器。

4．洗板工作液的配制（按各單位工藝要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：洗板工作液配方，pH值。

5．封閉液的配制

按配方配制封閉液。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：封閉液配方，pH值。

6．洗板和封閉

包被完成后，抽去孔內(nèi)包被液，用洗板工作液洗板后（按各單位工藝要求，可以不洗板），加入封閉液。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：封閉體積，溫度，時(shí)間，過程監(jiān)控。

質(zhì)檢項(xiàng)目：封閉前檢驗(yàn)包被均一性。

關(guān)鍵設(shè)備：包被機(jī)、（洗板機(jī)）、精密天平、加樣器。

7．抽干

封閉后的反應(yīng)板，抽干孔內(nèi)液體。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：過程監(jiān)控。

8．干燥

反應(yīng)板應(yīng)按工藝的要求進(jìn)行干燥。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：溫度，濕度，時(shí)間，過程監(jiān)控等。

9．密封包裝

將干燥后的反應(yīng)板用鋁箔袋密封包裝，內(nèi)放干燥劑（按各單位工藝要求，可以不放）。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：密封性能，標(biāo)示及效期等。

10．反應(yīng)板（半成品）檢驗(yàn)

對(duì)裝袋密封后的反應(yīng)板進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，外觀、板內(nèi)變異、板間變異。

關(guān)鍵設(shè)備：真空包裝機(jī)。

（二）滴配過程

1．酶結(jié)合物（也稱酶標(biāo)記物）的制備（根據(jù)各產(chǎn)品實(shí)際情況，該步驟可不進(jìn)行）

采用常規(guī)過碘酸鈉——乙二醇法將相關(guān)的抗體（或抗原）標(biāo)記辣根過氧化物酶（或其他酶），酶標(biāo)記后的抗體（或抗原）應(yīng)加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑保存于低溫。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：標(biāo)記方法，過程控制。

2．酶結(jié)合物的鑒定

（1）功能性實(shí)驗(yàn) 

將酶結(jié)合物用酶稀釋液稀釋后，用于產(chǎn)品的滴配，其結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（2）穩(wěn)定性 

將酶結(jié)合物用酶稀釋液稀釋，進(jìn)行2～8℃，及熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，滴配結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3．酶結(jié)合物稀釋液

按酶結(jié)合物稀釋液的配方配制，存放在2～8℃保存，并于規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：酶結(jié)合物稀釋液配方，pH值。

4．酶結(jié)合物工作濃度的滴配

取酶結(jié)合物，用酶結(jié)合物稀釋液稀釋到不同的濃度，用已制備好的反應(yīng)板進(jìn)行滴配。測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)的質(zhì)控品，確定使體系達(dá)到最優(yōu)的酶結(jié)合物工作濃度。

5．酶結(jié)合物工作液配制

將所需量酶結(jié)合物和酶結(jié)合物稀釋液按滴配濃度混合均勻。

質(zhì)檢項(xiàng)目：分裝前檢驗(yàn)，用配套的反應(yīng)板進(jìn)行檢驗(yàn)，外觀、靈敏度、質(zhì)控品測(cè)定值、定量產(chǎn)品應(yīng)作校準(zhǔn)品線性檢測(cè)。

6．酶結(jié)合物工作液的分裝

按工藝要求分裝酶結(jié)合物工作液。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：分裝前確認(rèn)試劑名稱、批號(hào)、數(shù)量，分裝量，封裝后密封性。

7．酶結(jié)合物工作液（半成品）檢驗(yàn)

對(duì)分裝后的酶結(jié)合物工作液進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，外觀、分裝量、靈敏度、校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線線性、質(zhì)控品測(cè)定值。

（三）校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照或質(zhì)控品的制備

1．稀釋液

按稀釋液的配方配制，存放在2～8℃或-20℃保存，并于有效期內(nèi)使用。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：稀釋液配方，pH值。

2．校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照的配制

校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照品的配制應(yīng)具有量值溯源性，可參照國家標(biāo)準(zhǔn)品、WHO標(biāo)準(zhǔn)品或其他級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行配制。

質(zhì)檢項(xiàng)目：分裝前檢驗(yàn)，準(zhǔn)確性、劑量－反應(yīng)曲線線性（定量產(chǎn)品）、質(zhì)控品測(cè)定值。

3．校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照或質(zhì)控品的分裝

按工藝要求分裝校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照或質(zhì)控品。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：分裝前確認(rèn)試劑名稱、批號(hào)、數(shù)量，分裝量。

4．校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照或質(zhì)控品（半成品）檢驗(yàn)

對(duì)分裝后的校準(zhǔn)品、陰/陽性對(duì)照或質(zhì)控品進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，外觀、分裝量、準(zhǔn)確性、劑量－反應(yīng)曲線線性（定量產(chǎn)品）、質(zhì)控品測(cè)定值。

（四）化學(xué)發(fā)光底物的制備

1．底物緩沖液

按底物緩沖液的配方配制，存放在2～8℃保存，并于有效期內(nèi)使用。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：底物緩沖液配方，pH值。 

2．化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）的配制

分別按氧化劑和發(fā)光劑的配方在底物緩沖液中加入相應(yīng)的氧化劑和發(fā)光劑

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：氧化劑和發(fā)光劑配方。

質(zhì)檢項(xiàng)目：分裝前檢驗(yàn)，本底、發(fā)光強(qiáng)度。

3．化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）的分裝

按工藝要求分裝化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）。

常規(guī)質(zhì)控項(xiàng)目：分裝前確認(rèn)試劑名稱、批號(hào)、數(shù)量，分裝量，封裝后密封性。

4．化學(xué)發(fā)光底物（半成品）檢驗(yàn)

對(duì)分裝后的化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，外觀、分裝量、本底、靈敏度、發(fā)光強(qiáng)度。

（五）分裝、燈檢和貼簽

分裝量用減重稱量法進(jìn)行測(cè)量，把質(zhì)量換算成體積后進(jìn)行分裝量的控制。燈檢是目測(cè)檢查各組分的色澤、分裝量以及是否混濁、有雜質(zhì)等。

（六）包裝

根據(jù)試劑盒包裝SOP要求及說明書的要求，以流水線操作形式進(jìn)行包裝。包裝時(shí)應(yīng)嚴(yán)格檢查品名、批號(hào)、裝量，認(rèn)真核對(duì)各物料數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。