PCR室作業(yè)指導(dǎo)書

文件編號：ABCD-3-PR-01~31

第A版

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批準(zhǔn)：

生效日期：2006年8月8日

ABCD人民醫(yī)院檢驗科

編  制  說  明

本分冊文件可以作為單獨(dú)申請衛(wèi)生部PCR實(shí)驗室認(rèn)可的全套作業(yè)文件，因此作為ISO15189質(zhì)量管理體系的PCR室作業(yè)文件，要對其重復(fù)部分進(jìn)行刪減，各檢驗科根據(jù)各自用途要求與特點(diǎn)進(jìn)行選用，特此說明。

                                              2006年8月8日

目    錄

  修 訂 頁

PCR實(shí)驗室的設(shè)置及管理

1．目的：建立實(shí)驗室的合理設(shè)置和科學(xué)管理，防止實(shí)驗污染，保證檢測結(jié)果的可靠性。

2．適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設(shè)置、工作流程和日常管理等。

3．負(fù)責(zé)人：

4．細(xì)則：

4．1 分子診斷室為檢驗科下設(shè)的專業(yè)實(shí)驗室，從事臨床標(biāo)本的基因擴(kuò)增檢測及相關(guān)科研工作。

4．2 本實(shí)驗室采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)作為臨床基因診斷的主要手段，實(shí)驗室分為三個區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)（第一區(qū)）、標(biāo)本處理區(qū)（第二區(qū)）、擴(kuò)增分析區(qū)（第三區(qū)）。每一工作區(qū)配備專用的設(shè)備、儀器、輔助設(shè)施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標(biāo)識。各區(qū)標(biāo)簽顏色：紅色（第一區(qū)）、白色或綠色（第二區(qū)）、藍(lán)色（第三區(qū)）；專用工作服：粉紅色（第一區(qū)）、白色（第二區(qū)）、藍(lán)色（第三區(qū)）。標(biāo)本的接收則在檢驗科標(biāo)本接收處進(jìn)行。

4．3 各工作區(qū)專用的儀器設(shè)備、辦公用品、工作服、實(shí)驗耗材和清潔用具等，不可混用。

4．4 各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務(wù)管理見各相關(guān)SOP文件。

4．5 嚴(yán)格遵守從“試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本處理區(qū)→擴(kuò)增分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進(jìn)入前一工作區(qū)。

4．6 非本實(shí)驗室工作人員，未經(jīng)許可不得入內(nèi)；進(jìn)修、實(shí)習(xí)或其他科室人員因科研活動需要，進(jìn)入實(shí)驗區(qū)域（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)）需首先熟悉本程序的各項規(guī)定并嚴(yán)格遵守執(zhí)行，在本實(shí)驗室人員監(jiān)督指導(dǎo)下進(jìn)行。

4．7 實(shí)驗完畢后做好清潔消毒工作。

5. 本文涉及以下圖表：

1.實(shí)驗室設(shè)計平面圖

PCR實(shí)驗室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作環(huán)境，以確保檢測結(jié)果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯、事故及糾紛的發(fā)生。

2．適用范圍：所有本實(shí)驗室人員。

3．負(fù)責(zé)人：

4．細(xì)則：

4．1 本實(shí)驗室進(jìn)行臨床基因擴(kuò)增檢測及相關(guān)實(shí)驗工作，不得進(jìn)行其它實(shí)驗操作。

4．2各區(qū)的用品不得混用。

4．3在各區(qū)的實(shí)驗操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴(yán)格按照操作規(guī)程。

4．4試劑準(zhǔn)備區(qū)只能進(jìn)行試劑的貯存及配制等相關(guān)操作（見相關(guān)SOP文件）。

4．5標(biāo)本處理區(qū)只能進(jìn)行臨床標(biāo)本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成（見相關(guān)SOP文件）。

4．6擴(kuò)增分析區(qū)只能進(jìn)行DNA或cDNA的擴(kuò)增、實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析（見相關(guān)SOP文件）。

4．7進(jìn)行實(shí)驗時嚴(yán)格執(zhí)行本實(shí)驗室的各項操作規(guī)程，及時做好各種操作記錄，力求準(zhǔn)確、可靠。實(shí)驗完畢，做好清潔、整理及分析統(tǒng)計等工作。

4．8室內(nèi)儀器由專人負(fù)責(zé)，未經(jīng)許可，不得隨意使用或挪用；愛護(hù)使用儀器，定期進(jìn)行保養(yǎng)與維修。

4．9 愛護(hù)醫(yī)院財產(chǎn)，注意安全；離開實(shí)驗室前應(yīng)關(guān)好門窗，檢查水、電等。

PCR實(shí)驗室內(nèi)務(wù)管理制度

1．目的：保證實(shí)驗室日常內(nèi)務(wù)管理及清潔工作順利進(jìn)行。

2．適用范圍：實(shí)驗室相關(guān)人員及醫(yī)院相關(guān)清潔工人。

3．負(fù)責(zé)人：

4．細(xì)則：

4．1非本室工作人員未經(jīng)允許不得進(jìn)入實(shí)驗室。

4．2各區(qū)的用品不得混用。

4．3實(shí)驗人員要有強(qiáng)烈的時間觀念，按時上下班，不遲到、早退。

4．4進(jìn)入實(shí)驗室的工作人員必須遵守實(shí)驗室的單一流向的規(guī)定，禁止逆向走動。

4．5所有儀器（如PCR擴(kuò)增儀）須有專人負(fù)責(zé)，并有使用維護(hù)記錄；實(shí)驗人員必須熟悉儀器性能后方允許操作，并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。

4．6所有試劑進(jìn)購、配制、質(zhì)檢、使用均要有記錄，未經(jīng)允許不得隨意帶出本實(shí)驗室。

4．7每天了解儀器運(yùn)轉(zhuǎn)情況及試劑使用情況，確保儀器整潔安全，試劑合格使用。

4．8各區(qū)的各種清潔消毒均應(yīng)有記錄，工作衣消毒時注意各區(qū)應(yīng)分開進(jìn)行處理。

4．9注意保持實(shí)驗室衛(wèi)生整潔，嚴(yán)禁在室內(nèi)抽煙、吃零食，非實(shí)驗操作人員應(yīng)盡量少入。4. 10下班前檢查門、窗、水、電，節(jié)假日應(yīng)指定人員負(fù)責(zé)檢查實(shí)驗室的儀器、設(shè)備。

PCR實(shí)驗室人員的配置及管理

1．目的：保證實(shí)驗室有足夠數(shù)量的合格的具備開展該類實(shí)驗?zāi)芰Φ膶?shí)驗人員。

2．適用范圍：適用于實(shí)驗室人員配置、管理、培訓(xùn)及考核。

3．負(fù)責(zé)人：

4．細(xì)則：

4．1   人員要求

4．1．1   本實(shí)驗室工作人員應(yīng)為醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)或相關(guān)專業(yè)畢業(yè)，具有中級以上技術(shù)職稱或?qū)？埔陨蠈W(xué)歷。

4．1．2    實(shí)驗室工作人員應(yīng)參加衛(wèi)生部或省臨檢中心舉辦的PCR技術(shù)培訓(xùn)，并取得合格證。

4．1．3    對于新進(jìn)入本室的人員，如尚未取得PCR技術(shù)培訓(xùn)合格證，應(yīng)在實(shí)驗室有培訓(xùn)合格證的上級技術(shù)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗工作，實(shí)驗報告由有資格人員出具，并應(yīng)在最短的時間內(nèi)取得上崗培訓(xùn)合格證。

4．2   人員配置

4．2．1   實(shí)驗室應(yīng)根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員，目前實(shí)驗室有主管技師2人、技師1人，3人都已獲得培訓(xùn)合格證，視工作量的增加和業(yè)務(wù)發(fā)展需要，會適當(dāng)增加工作人員。

4．2．2   各級技術(shù)人員履行相應(yīng)的工作職責(zé)。

4．3   人員培訓(xùn)及考核

4．3．1   實(shí)驗室負(fù)責(zé)人或負(fù)責(zé)人指定人員參加每年衛(wèi)生部PCR室間質(zhì)評總結(jié)會。

4．3．2   實(shí)驗室工作人員每1～2年至少參加1次PCR技術(shù)的省級或國家級繼續(xù)教育項目，參加相關(guān)學(xué)術(shù)交流會議。

4．3．3   安排未取得上崗培訓(xùn)合格證的工作人員在合適的時間內(nèi)參加技術(shù)培訓(xùn)。

4．3．4  科室不定期組織實(shí)驗室內(nèi)部實(shí)驗人員學(xué)習(xí)、更新核酸擴(kuò)增方面的相關(guān)知識，提升自身的理論學(xué)習(xí)水平。特別是在標(biāo)本接收區(qū)采血、接收標(biāo)本的人員，需定期對其進(jìn)行有關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)，標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)戎�識的培訓(xùn)。一些科室的送檢標(biāo)本由該科室的人員送到標(biāo)本接收區(qū)，對這些臨床醫(yī)護(hù)人員也要定期進(jìn)行有關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)，標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)戎�識的培訓(xùn)。

4．3．5  本實(shí)驗室工作人員每年進(jìn)行考核一次,考核內(nèi)容:

a)日常工作質(zhì)量

b)室內(nèi)質(zhì)控測評

c)室間質(zhì)控測評

d)在抱怨處理中的表現(xiàn)

 4．3．6  本實(shí)驗室工作人員實(shí)行嚴(yán)格獎懲制度,有下列表現(xiàn)者可受獎:

a)工作質(zhì)量高, 質(zhì)控測評成績優(yōu)秀者

b)有科研能力,并有一定數(shù)量和質(zhì)量的論文發(fā)表

c)有獨(dú)創(chuàng)性工作成果,經(jīng)鑒定認(rèn)可者

d)受到有關(guān)部門或群眾嘉獎?wù)?/P>

有下列情況者將受到懲處:

a)工作質(zhì)量問題較多，質(zhì)控測評成績不合格；

b)不遵守規(guī)章制度并造成一定影響；

c)不求上進(jìn)。

4．3．7  本實(shí)驗室工作人員獎懲方法分精神及物質(zhì)兩類,經(jīng)實(shí)驗室上報醫(yī)院及有關(guān)部門批準(zhǔn)后執(zhí)行。

4．3．8 本實(shí)驗室工作人員均建立業(yè)績檔案,實(shí)行能進(jìn)能出制度,不斷吸收高質(zhì)量人員,加強(qiáng)培訓(xùn)和提高,對于不適合本室工作的人員要及時調(diào)離。

4．4   人員管理

4．4．1 實(shí)驗室建立所有工作人員的技術(shù)檔案，包括：學(xué)歷、任職資格、發(fā)表論文、研究成果、培訓(xùn)等相關(guān)材料復(fù)印件。

4．4．2  技術(shù)檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1次，電子檔案隨時更新。

5. 本文涉及以下表格

實(shí)驗室主要負(fù)責(zé)人簡歷表        

PCR實(shí)驗室工作人員一覽表        

培訓(xùn)申請表                      

  年度培訓(xùn)計劃表                   

培訓(xùn)記錄表                      

員工培訓(xùn)履歷表                   

人員檔案卡                       

PCR實(shí)驗室清潔程序

1．目的：保證實(shí)驗室環(huán)境的整潔，防止污染。

2．適用范圍：適于實(shí)驗室工作環(huán)境、實(shí)驗臺面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。

3．負(fù)責(zé)人：        操作人：

4．細(xì)則：

4．1 實(shí)驗室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。

4．2 合理規(guī)劃實(shí)驗室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲存處，常用的物品要容易尋找到。

4．3抽屜、柜子、文件類物品要作好標(biāo)記，以方便識別。

4．4 實(shí)驗結(jié)束后用2%戊二醛對臺面進(jìn)行清潔，并用移動紫外燈進(jìn)行消毒。

4．5每天對使用過的移液器用75%酒精進(jìn)行擦拭。每周1次對移液器咀進(jìn)行75%酒精浸泡15分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應(yīng)隨時浸泡處理。

4．6實(shí)驗過程中如發(fā)生標(biāo)本或試劑外濺，應(yīng)立即用2%戊二醛滴上，濾紙蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用移動紫外燈消毒。

4．7 每天實(shí)驗前開啟各區(qū)的通風(fēng)系統(tǒng)，各區(qū)實(shí)驗結(jié)束后，分別打開傳遞窗紫外燈、移動紫外燈（對實(shí)驗臺面消毒）、天花板紫外燈消毒實(shí)驗室，每次開啟 30～60分鐘。

4．8 待紫外燈消毒時間足夠后，依次關(guān)閉各區(qū)紫外燈并記錄。

4．9 依次清潔三個區(qū)的實(shí)驗臺面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方向流程的原則來進(jìn)行清潔。

4．10 處理好各區(qū)廢棄物，交醫(yī)院集中處理。

4．11 每周將工作服交院洗衣房洗滌消毒，不同實(shí)驗區(qū)的工作服隔開洗滌。

5. 本文涉及以下表格

實(shí)驗室清潔消毒記錄表          

垃 圾 處 理 記 錄 表          

PCR標(biāo)本唯一標(biāo)識編號規(guī)則

1．目的：保證標(biāo)本編號的唯一性，也是準(zhǔn)確發(fā)放報告的基礎(chǔ)。

2．適用范圍：使用核酸擴(kuò)增熒光檢測實(shí)驗室所開展的四種檢測項目：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、結(jié)核桿菌、沙眼衣原體。

3．負(fù)責(zé)人：       操作人：

4．程序：

4．1 按檢測日期分類標(biāo)記

根據(jù)標(biāo)本送檢的日期，每天的標(biāo)本對應(yīng)標(biāo)記一種唯一的代號。如當(dāng)天為2005年3月1日，則編為050301。

4．2 按檢測類型分類標(biāo)記

根據(jù)檢測項目的不同，每種檢測項目對應(yīng)標(biāo)記一種唯一的代號。如乙型肝炎病毒標(biāo)記為B，丙型肝炎病毒標(biāo)記為HC，結(jié)核桿菌標(biāo)記為T，沙眼衣原體為C。

4．3 按驗單接收順序編號

在同種檢測類型的驗單中，按驗單順序編號。如第一個檢測乙型肝炎病毒的驗單編為B01，第二個檢測乙型肝炎病毒的驗單編為B02，第三個檢測結(jié)核的驗單編為B03等。

4．4 特殊標(biāo)本的編號

如有特殊情況，應(yīng)在標(biāo)記前面增加特異字母區(qū)別開，如住院的單和門診的單、其它醫(yī)院送來的單和本醫(yī)院的單要區(qū)分開等。

4．5 編號步驟

a）對當(dāng)天送來的標(biāo)本，根據(jù)編號的基本原則編號，每個樣本的每個檢測項目對應(yīng)一個唯一的編號（如050301T04）。

b）   用筆在每張檢驗申請單和對應(yīng)的樣品管上作好相同的標(biāo)記。

c）   做好標(biāo)本的接收記錄，每個樣本的記錄都應(yīng)包括以下信息：接收時間、醫(yī)院、科室、送檢醫(yī)生、患者姓名、性別、年齡、標(biāo)本類別、標(biāo)本狀態(tài)、送標(biāo)本者、接收人、檢驗單號、標(biāo)本唯一統(tǒng)編號等。

d）處理好樣品、點(diǎn)樣后，將反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀上開始擴(kuò)增。

f）擴(kuò)增得到結(jié)果后，先在統(tǒng)計簿上填入結(jié)果，作好記錄，再一一把實(shí)驗結(jié)果填入相應(yīng)申請單。

g）發(fā)放檢驗報告單。

5. 本文涉及以下圖表：

PCR擴(kuò)增接收標(biāo)本記錄表    

PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗室的要求

1．目的：規(guī)定在各區(qū)內(nèi)所進(jìn)行的工作及其操作。

2．適用范圍：所有在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行的工作。

3．負(fù)責(zé)人：      操作人：

4．程序：

實(shí)驗室分四區(qū):標(biāo)本接收區(qū)；試劑貯存、準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增區(qū)。進(jìn)入各區(qū)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑貯存、準(zhǔn)備區(qū)——標(biāo)本接收區(qū)——標(biāo)本制備區(qū)——擴(kuò)增區(qū)。各區(qū)及其設(shè)備、物品必須有明確的標(biāo)記，嚴(yán)禁混用。

進(jìn)入PCR實(shí)驗室的工作人員（含衛(wèi)生員），都必須遵守實(shí)驗室的規(guī)則，尤其嚴(yán)格遵守進(jìn)入PCR實(shí)驗室的唯一流向。不可進(jìn)入PCR擴(kuò)增后區(qū)打掃衛(wèi)生，再返回擴(kuò)增前區(qū)工作。防止非本室工作人員串崗，進(jìn)入本室。尤其不得為找人，而逆向誤入PCR實(shí)驗室。

總則

（1）       PCR實(shí)驗室工作人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)檢驗、微生物檢驗基本知識，大專以上學(xué)歷，并受過PCR實(shí)驗的基礎(chǔ)知識和技能培訓(xùn)。

（2）       PCR實(shí)驗室分試劑準(zhǔn)備，樣本準(zhǔn)備，PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測四個室，各室的實(shí)驗物品（含加樣器，試管架，吸頭，記錄紙，筆等），不得混用，須貼上標(biāo)簽予以區(qū)別。

（3）       實(shí)驗室技術(shù)人員必須嚴(yán)格按照PCR實(shí)驗室操作程序進(jìn)行，包括實(shí)驗室擦洗。臺面消毒，離心管，吸頭的無菌滅活準(zhǔn)備，儀器使用和廢棄物處理等。

（4）       進(jìn)入實(shí)驗室的工作人員必須更換各室不同的工作服（含帽和鞋），勤換洗工作服，以及遵守實(shí)驗室的唯一流向的規(guī)定，嚴(yán)禁反向流動。

（5）       進(jìn)入PCR實(shí)驗室后區(qū)的物品不許帶進(jìn)PCR實(shí)驗室前區(qū)。每天實(shí)驗開始前，必須清潔地面和消毒實(shí)驗室前區(qū)。實(shí)驗結(jié)束應(yīng)紫外線消毒實(shí)驗臺面，產(chǎn)物分析室紫外燈最好徹夜開啟，排風(fēng)扇應(yīng)晝夜工作。每天下班前處理好廢物，應(yīng)關(guān)好水、電、煤氣和門窗。

（6）       定期校準(zhǔn)和維修PCR儀、酶標(biāo)儀及離心機(jī)、水浴箱等儀器設(shè)備。

（7）       實(shí)驗室內(nèi)不得飲食、吸煙。

4.1標(biāo)本接收區(qū)

4.1.1實(shí)驗人員進(jìn)入該區(qū)須穿本區(qū)白色工作服，接收標(biāo)本須戴一次性手套。

4.1.2記錄實(shí)驗室干、濕度，繪制冰箱溫度圖。使用帶有本區(qū)標(biāo)識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細(xì)。

4.1.3對送檢的標(biāo)本實(shí)行雙簽制度，并仔細(xì)檢查是否符合檢測要求，對有不符合要求的標(biāo)本及時通知相關(guān)科室重新采樣，并作記錄，每份標(biāo)本需給出唯一性編號。

4.1.4本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封好，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將垃圾帶出實(shí)驗室。

4.1.5每次實(shí)驗結(jié)束后，清潔實(shí)驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。記錄紫外燈使用情況。

4.2試劑貯存、準(zhǔn)備區(qū)

4.2.5使用帶有本區(qū)標(biāo)識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細(xì)。

4.2.6準(zhǔn)備好的試劑送入下一區(qū) ，還原實(shí)驗臺面，將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將本區(qū)垃圾帶出實(shí)驗室。

4.2.7白色工作服留在本區(qū)。

4.2.8本區(qū)維持相對正壓狀態(tài)（開啟緩沖區(qū)的排氣扇）。實(shí)驗結(jié)束后，清潔實(shí)驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。

4.3標(biāo)本制備區(qū)

4.3.1實(shí)驗人員進(jìn)入該區(qū)須在緩沖區(qū)更換專用藍(lán)色工作服及拖鞋。實(shí)驗中須使用一次性帽子，戴手套，手套在實(shí)驗過程中疑有污染應(yīng)立即更換。

4.3.2將傳入本區(qū)的試劑放入冰箱冷凍室試劑存放專區(qū)暫存。記錄實(shí)驗室干、濕度，繪制冰箱溫度圖。

4.3.3將冰箱內(nèi)二周前的標(biāo)本密封丟入垃圾筐，然后記錄標(biāo)本的保存情況。

4.3.4使用帶有本區(qū)標(biāo)識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細(xì)。

4.3.5按試劑盒說明書對標(biāo)本進(jìn)行處理，將處理好的標(biāo)本在超凈工作臺內(nèi)加樣，記錄標(biāo)本的處理過程。

4.3.6將加樣后的試劑傳送下一區(qū)，還原實(shí)驗臺面，關(guān)閉所有儀器，記錄儀器使用時間和運(yùn)行狀態(tài)。

4.3.7使用過的離心管、吸頭須置于盛有10％84液的廢液缸中，實(shí)驗結(jié)束后方丟入垃圾袋，患者樣品應(yīng)按有生物傳染性危險品對待。

4.3.8將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將垃圾帶出本區(qū)。

4.3.9將藍(lán)色工作服留在本區(qū)。

4.3.10本區(qū)應(yīng)避免不必要的走動，同時維持相對正壓狀態(tài)，實(shí)驗結(jié)束后，清潔實(shí)驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。

4.4擴(kuò)增產(chǎn)物檢測區(qū)

4.4.1實(shí)驗人員進(jìn)入該區(qū)須在緩沖區(qū)更換專用粉色工作服及拖鞋。

4.4.2記錄實(shí)驗室干、濕度，繪制冰箱溫度圖。

4.4.3使用帶有本區(qū)標(biāo)識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細(xì)。

4.4.4將傳入本區(qū)加樣后的試劑上機(jī)擴(kuò)增。

4.4.5擴(kuò)增完成后，記錄檢測結(jié)果，及時發(fā)放報告單，記錄儀器使用時間和運(yùn)行狀態(tài)。

4.4.6將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，然后將垃圾帶出實(shí)驗室。

4.4.7將粉色工作服留在本室再離開實(shí)驗室

4.4.8嚴(yán)禁本區(qū)物品帶至其他區(qū)，該區(qū)需維持負(fù)壓狀態(tài)，排氣扇24小時排氣，實(shí)驗結(jié)束后清潔該區(qū)打開紫外燈照射，最好整夜消毒，記錄紫外燈使用情況。

5. 本文涉及以下表格

PCR實(shí)驗室環(huán)境溫濕度記錄表        

冰箱溫度質(zhì)控圖                    

實(shí)驗室清潔消毒記錄表              

垃 圾 處 理 記 錄 表             

紫外消毒車消毒記錄表              

PCR廢棄物的處理程序

1．目的：保證實(shí)驗室、實(shí)驗人員和外部環(huán)境的安全。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光檢測實(shí)驗室常用化學(xué)試劑（NaOH、EDTA、乙醇、生理鹽水等）、實(shí)驗室廢棄物的處理；

3．負(fù)責(zé)人：        操作人：

4．細(xì)則：

4.1科室職責(zé)應(yīng)對本室工作人員講明本程序在預(yù)防交叉、實(shí)驗室污染及切斷傳播途徑中的重要性，并要求嚴(yán)格執(zhí)行。

4.2實(shí)驗室所有垃圾，裝入專用污物袋內(nèi)，各區(qū)備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾袋（黃色）。使用過的一次性消耗品(如試管、吸頭、離心管、等)，先放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡2～4小時后，再放入黃色垃圾袋內(nèi)，使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋內(nèi)交醫(yī)院集中處理。

4.3 夾取標(biāo)本的工具，如鉗、鑷、接種環(huán)、吸管等，用后均應(yīng)消毒清潔，進(jìn)行微生物檢驗時，應(yīng)重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品干熱或壓力蒸汽滅菌。

4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小時后，放入黃色垃圾袋內(nèi)交醫(yī)院集中處理。

4.5 廢棄標(biāo)本如血、尿、胸水、腹水、腦脊液、唾液、胃液、腸液、關(guān)節(jié)腔液等用10%的84液浸泡2～4小時后，交醫(yī)院集中處理。

4.6 盛標(biāo)本的容器，若為一次性使用的紙質(zhì)容器及其外面包被的廢紙，放入污物袋里交醫(yī)院處理；對可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15分鐘或加入10%次氯酸鈉溶液浸泡2～4小時，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用于微生物培養(yǎng)采樣者，用壓力蒸汽滅菌后備用。

4.7 廢棄標(biāo)本及其容器裝入黃色垃圾袋內(nèi)、封閉，交醫(yī)院污物處理中心處理。

4.8日常生活垃圾如紙屑等按一般垃圾交醫(yī)院處理。

5. 本文涉及以下表格

PCR廢血標(biāo)本處理交接表                

基因擴(kuò)增檢測實(shí)驗及結(jié)果分析

1、目的：保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。

2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機(jī)。

3．負(fù)責(zé)人：肖靜  操作人：胡可存  蔣藝勤

4、標(biāo)準(zhǔn)程序：

4.1 基因擴(kuò)增檢測標(biāo)準(zhǔn)程序：擴(kuò)增反應(yīng)前須先在樣本輸入模板上按照事先排好的標(biāo)本位置進(jìn)行設(shè)置。每次實(shí)驗除待檢標(biāo)本，還需包括：陰性對照、陽性對照、室內(nèi)質(zhì)控品各一份，一組陽性標(biāo)準(zhǔn)品（4個梯度10⁸、10⁶、10⁵、10⁴）。

4.1.1打開電腦電源開關(guān)，進(jìn)入Windows NT界面。

4.1.2 接著打開PCR儀電源開關(guān)，預(yù)熱5分鐘。 

4.1.3雙擊電腦桌面的ABI Prism 5700 SDS Software圖標(biāo)進(jìn)入程序設(shè)置界面。

4.1.4單擊 “文件”菜單中的 “新建”命令，（或單擊工具欄中的“新建”按扭）。在測定、容器和模板中做相應(yīng)的選擇，點(diǎn)擊OK。

4.1.5應(yīng)用檢測管理程序，并將其添加到樣品板文檔中。

4.1.6檢測反應(yīng)管，

4.1.7 根據(jù)當(dāng)次實(shí)驗所需條件編輯時間和溫度。運(yùn)行樣品板文檔。

4.2 結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)程序 ：

應(yīng)按以下步驟進(jìn)行：全部曲線——陰性對照——陽性對照——陽性室內(nèi)質(zhì)控品——陽性標(biāo)準(zhǔn)品——逐個分析（標(biāo)出陽性標(biāo)本和可疑標(biāo)本）——調(diào)整參數(shù)，獲得較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示定量結(jié)果——登記，發(fā)報告。

4.2.1 整體曲線的觀察：將所有曲線選中進(jìn)行整體觀察

1）觀察是否存在污染情況（包括標(biāo)本污染和試劑污染），特別應(yīng)注意大量曲線

在同一Ct值出現(xiàn)上漲的情況。

2）觀察是否有光路傳導(dǎo)阻滯或電壓波動等機(jī)器原因形成的異常曲線。

4.2.2 陰性對照的分析

陰性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陰性標(biāo)本。

作用：用以監(jiān)測實(shí)驗室和前處理過程中是否存在污染。

4.2.3 陽性對照的分析

陽性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陽性標(biāo)本。

作用：用以監(jiān)測實(shí)驗?zāi)芊裾�常檢出陽性標(biāo)本，避免假陰性的出現(xiàn)。

4.2.4 室內(nèi)質(zhì)控品的分析

室內(nèi)質(zhì)控品：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知濃度室內(nèi)質(zhì)控品。

作用：用以監(jiān)控日常實(shí)驗的精密度。

4.2.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的分析

1）各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽模稀釋可能存在問題，提示實(shí)驗中存在較大人為誤差。

2）觀察各曲線的Ct值是否在平日的正常位置。

情況1：若出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而各曲線Ct 值均后移，則判斷是否為試劑擴(kuò)增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。

情況2：出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標(biāo)準(zhǔn)品的降解情況。

3）每日必做10⁴標(biāo)準(zhǔn)品，用作以下三方面監(jiān)控：一是否存在操作誤差，如加樣量過少等原因?qū)е?0⁴標(biāo)準(zhǔn)品未能檢出；二是否存在稀釋后的梯度放置過久，低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品降解的情況；三是若高拷貝標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)Ct值后移，且能排除情況1、2，則判斷是否為試劑靈敏度下降。

4.2.6 單個曲線的判斷：逐個分析每條曲線，判斷曲線的陰陽性或?qū)倏梢汕�線。（可疑標(biāo)本是指曲線在25個Ct值后出現(xiàn)上漲且平臺趨勢不明顯或上漲幅度比較低的標(biāo)本�？梢蓸�(biāo)本要第二天重做，兩次結(jié)果一致則報陽性，否則結(jié)果報陰性。）

曲線觀察內(nèi)容：在基線選擇2～8時觀察熒光強(qiáng)度（是否有三期特征）。并分別在Delta Rn vs.Cycle 、Ct vs.Well Number和 Rn vs.Cycle這三種擴(kuò)增圖形式下分析數(shù)據(jù)。

4.2.7 得出定量結(jié)果：調(diào)節(jié)基線和閾值以得到一較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。電腦據(jù)此曲線給出陽性結(jié)果值。此時應(yīng)排除某些陰性標(biāo)本因熒光曲線假性上揚(yáng)而得出的假陽性結(jié)果和某些弱陽性標(biāo)本因終末熒光值過低而顯示的假陰性。

4.2.8 發(fā)放報告：及時登記檢測結(jié)果記錄，發(fā)放臨床報告。

4.3實(shí)驗結(jié)果無效的判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當(dāng)次實(shí)驗結(jié)果不可發(fā)，查找原因，重做實(shí)驗。

4.3.1 陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增。

4.3.2 陽性對照無擴(kuò)增。

4.3.3大批甚至所有的標(biāo)本都擴(kuò)增了。

4.3.4 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測結(jié)果出現(xiàn)失控情況，實(shí)驗失控的具體標(biāo)準(zhǔn)詳見室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

4.4實(shí)驗結(jié)果有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)到下列要求后，當(dāng)次實(shí)驗有效，可以發(fā)放結(jié)果。

4.4.1陰性對照沒有擴(kuò)增，陽性對照擴(kuò)增。

4.4.2陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)三個參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。

4.4.3室內(nèi)質(zhì)控血清檢測結(jié)果處于在控狀態(tài)，具體標(biāo)準(zhǔn)詳見

5. 本文涉及以下表格

室間質(zhì)評記錄表                        

PCR室內(nèi)質(zhì)控記錄表                  

室內(nèi)質(zhì)控圖                         

臨床標(biāo)本的保存操作程序

1．目的：臨床標(biāo)本正確保存，以便必要時復(fù)查。

2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標(biāo)本。

3．負(fù)責(zé)人：       操作人：

4．程序：

4．1 處理前的標(biāo)本保存

a）HBV：全血標(biāo)本可4℃下短期（24h內(nèi)）保存，長期保存則需分離出血清（血漿），保存于-20℃下。

d）HCV：在1小時內(nèi)分離血清，吸取200µl，加入20u Rnasin，保存于-20℃。盡可能快的提取RNA。

c）TB：痰或胸腹水、腦脊液、膿液標(biāo)本用于TB檢測的短期保存可置于4℃下，長期保存則于-20℃下。

d）CT：標(biāo)本短期（24h內(nèi)）保存置于4℃下，長期保存則需在-20℃下。

4．2 報告發(fā)出后的標(biāo)本保存：

a） 提取的核酸標(biāo)本當(dāng)天檢測可置4℃保存，如當(dāng)天不檢測應(yīng)置-20℃保存。報告發(fā)出后第二天丟棄。

b） 原始血清/血漿樣本在報告發(fā)出后放入低溫冰箱-20℃保存1個星期，以備復(fù)查。超過1個星期保存期的標(biāo)本由室負(fù)責(zé)人酌情處理，一般按生物傳染性物品交醫(yī)院統(tǒng)一處理。

c）血清/血漿標(biāo)本放置低溫冰箱保存時須有記錄，按編號順序存放，并由專人負(fù)責(zé)管理。

4．3 特殊標(biāo)本的處理：

對暫不檢測的項目和規(guī)定時間外收到的零散樣本，要隨時登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗。對特殊樣本或特殊病人的樣本，實(shí)行“首接”負(fù)責(zé)制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣本，以及特殊病人的樣本一律實(shí)行“首接”負(fù)責(zé)制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均須負(fù)其責(zé)任，不得以任何借口推托，及時和正確保管和轉(zhuǎn)送樣本到有關(guān)實(shí)驗室或有關(guān)人員，同時作交班記錄和雙簽名。對于做長期病情動態(tài)考察的病人標(biāo)本一律置于-20℃下長期保存，使用時再按需取出檢測。

5. 本文涉及以下圖表：

PCR擴(kuò)增接收標(biāo)本記錄表                  

拒收標(biāo)本記錄本                         

標(biāo)本超低溫保存記錄表                 

臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、接收程序

1．目的：規(guī)范臨床待檢標(biāo)本的正確采集、送檢和處理。

2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標(biāo)本。

3．負(fù)責(zé)人：      操作人：

4．程序：

4．1 標(biāo)本的采集

4．1．1 標(biāo)本由臨床各科室接受過臨床基因擴(kuò)增檢測有關(guān)標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸知識培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員采集并送至實(shí)驗室。

4．1．2標(biāo)本采集要求

a）血液標(biāo)本：用2ml真空采集管或1.5ml高壓滅菌離心管采集血液標(biāo)本，血標(biāo)本采集后在2小時內(nèi)送達(dá)實(shí)驗室（HCV采用EDTA抗凝的血漿）。離心（檢驗單與標(biāo)本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1.5ml的離心管中，編號。

b）痰標(biāo)本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標(biāo)本送檢。（對于無痰或少痰的患者，可用45℃加溫的100g/L NaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導(dǎo)咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標(biāo)本。）標(biāo)本在室溫下保存不能超過24小時。

c）生殖道拭子：尿道或陰道分泌物由醫(yī)生用專用取樣拭子（滅菌，一次性）采集樣本，及時送檢。采集生殖道拭子標(biāo)本，要求男性病人在采樣前2小時內(nèi)不能排尿，采樣時，將棉拭子伸入男性尿道及女性宮頸口2～3cm，轉(zhuǎn)動一周以獲得上皮細(xì)胞。

d）尿液：由病人自留尿液于無菌封閉的杯中送檢。

e）腦脊液和胸腹水：由臨床醫(yī)生采集后放入消毒的試管中及時送檢。

注意：所有上述用于臨床標(biāo)本采集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌和密封。

4．2 標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本采集后，密閉、標(biāo)（貼）姓名，應(yīng)盡可能快的送至檢測實(shí)驗室，如運(yùn)送時間需2小時以上，必須用冰盒送至實(shí)驗室。

標(biāo)本中如加入了適當(dāng)?shù)姆�(wěn)定劑，如用于RNA測定加入4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）的血清（漿）標(biāo)本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。

4．5 接收

4．5．1嚴(yán)格對各類樣本的查對和雙簽制度，對病房各樣本及時進(jìn)行驗收，查對，不符合要求的樣本一律退回，并有書面記錄。

4．5．2 分類驗證

4．5．2．1 一般內(nèi)容

進(jìn)入實(shí)驗室的樣本在進(jìn)行編號、離心前，工作人員應(yīng)再次認(rèn)真查對姓名，聯(lián)號，住院號，病區(qū)床號，項目等。對不符合要求者應(yīng)作記錄，并及時通知采樣科室，正確及時地補(bǔ)采樣，以免延誤病人的檢測結(jié)果報告。對書寫不清楚的申請單，當(dāng)事者要及時與病房聯(lián)系(可電話)，明確受檢者姓名，住院號，性別，年齡，病區(qū)，床號和檢驗項目等；并作相應(yīng)記錄。

4．5．2．2  按檢測項目驗證標(biāo)本

a）HBV：所需標(biāo)本類型為未溶血的血清或血漿，注意血漿標(biāo)本所用的抗凝劑，用EDTA-K₂，不可使用肝素。標(biāo)本為全血時應(yīng)及時分離出血漿保存。

b）HCV：同上，但標(biāo)本為血清時，要在1小時內(nèi)分離出血清用于檢測。

c）TB：晨起第一口深部痰(不能為唾液)、胸腹水、腦脊液、膿液或穿刺液。

d）CT：尿道或陰道分泌物。

4．5．2．3 實(shí)驗室人員對標(biāo)本進(jìn)行查驗，出現(xiàn)下表中不合要求的情況時，應(yīng)拒收標(biāo)本，登記并告知相關(guān)科室。

4．5．2．4 拒收程序

a）對拒收的不合格標(biāo)本應(yīng)在拒收標(biāo)本記錄本上登記。

b）填寫不合格標(biāo)本處置單，并隨同申請單送返送檢科室。

c）必要時電話告之相關(guān)科室醫(yī)生或護(hù)士。

5.  本文涉及以下圖表：

PCR擴(kuò)增接收標(biāo)本記錄表          

PCR擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表         

PCR生物安全防護(hù)措施

1．目的：預(yù)防工作人員在實(shí)驗過程中被感染或污染。

2．適用范圍：適用于本室所有工作人員。

3．負(fù)責(zé)人：     操作人：

4．細(xì)則：

4．1  實(shí)驗人員在實(shí)施生物防護(hù)措施時，應(yīng)嚴(yán)格遵守各項相應(yīng)的規(guī)章制度，建立起強(qiáng)烈的生物防護(hù)意識。

4．2  每天更換廢液缸的2%戊二醛溶液，并保證2%戊二醛溶液用量為廢液缸內(nèi)總液量的五分之一左右。配置消毒液時，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。

4．3  實(shí)驗臺面日常清潔時使用75%的酒精擦拭。

4．4  每區(qū)每次實(shí)驗后紫外燈照射30～60分鐘，如有需要可延長照射時間。

4．5  所有來自病人的血液或體液標(biāo)本均應(yīng)視作傳染源，因此在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸過程中，標(biāo)本容器應(yīng)完好無泄漏。

4．6  處理標(biāo)本時應(yīng)穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標(biāo)本以及試劑，應(yīng)立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細(xì)菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。

4．7  在實(shí)驗過程中，病人標(biāo)本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內(nèi)應(yīng)立即用清水洗。

4．8  實(shí)驗過程中在使用針具等銳器時，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時，應(yīng)立即脫下手套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時進(jìn)行預(yù)防補(bǔ)救措施。

4．9  在實(shí)驗過程中病人標(biāo)本（血液、體液）外漏時，應(yīng)立即用2%戊二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。

4．10 實(shí)驗完畢離開時，應(yīng)脫下所有該實(shí)驗區(qū)個人防護(hù)裝備。

4．11 實(shí)驗完畢后應(yīng)對實(shí)驗室進(jìn)行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故應(yīng)立即報告科室負(fù)責(zé)人，當(dāng)事人應(yīng)立即注射相關(guān)疫苗或進(jìn)行預(yù)防性治療，并進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察，嚴(yán)重者應(yīng)報告院技術(shù)負(fù)責(zé)人。

5. 本文涉及以下表格

紫外消毒車消毒記錄表         

實(shí)驗室清潔消毒記錄表         

PCR實(shí)驗室化學(xué)試劑配制程序

1．目的：保證實(shí)驗中用到的各種溶液符合實(shí)驗要求。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光檢測實(shí)驗室常用溶液：4%NaOH溶液、75%酒精、消毒劑（三氯異氰尿酸或 二氯異氰尿酸鈉）、2%戊二醛溶液等。

3．負(fù)責(zé)人：      操作人：

4．程序：

4．4 化學(xué)試劑的配制：

4．4．1 用具：干燥潔凈的250ml量桶一只，1000ml量桶一只，1000ml燒杯一只，三角燒瓶兩只，天平一架，100ml塑料試劑瓶、2000ml廣口瓶各一只。

4．4．2 配制步驟：

4．4．2．1 配制4%NaOH溶液:

a）用天平稱取4克分析純的NaOH固體，置于一只三角燒瓶中。

b）用250ml量桶準(zhǔn)確取100ml水，緩緩注入盛放NaOH固體的三角燒瓶中。

c）搖蕩三角燒瓶使NaOH固體充分溶解。

d）然后緩緩傾倒入100ml塑料試劑瓶中密封保存?zhèn)溆谩?/P>

4．4．2．2 配制消毒劑:

a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達(dá)到500mg/L，即可達(dá)到消毒作用。

b）消毒劑為粉狀（20克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取500g，倒入燒杯中，緩緩加入1000ml水充分溶解，備用。

c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。

4．4．2．3 配制75%酒精溶液:

a）一般常規(guī)消毒的75%酒精由醫(yī)院藥劑科提供。

b）RNA提取的75%酒精的配制，試劑盒提供DEPC水，酒精用分析純的無水酒精，根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)本數(shù)量進(jìn)行配制。

4．4．2．4 配制2%戊二醛溶液:

a）準(zhǔn)確量取戊二醛原液20ml倒入1000ml燒杯中。

b）量取980ml水，緩緩倒入1000ml燒杯中，混勻，加至2000ml廣口瓶中備用。

注意事項：每份配制好的溶液保質(zhì)期為14天

PCR實(shí)驗室記錄管理制度

1、目的：確保檢驗資料的記錄、保存狀態(tài)在控

2、適用范圍：實(shí)驗過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)、文本資料的記錄

3．負(fù)責(zé)人：         操作人：

4、工作程序：

4.1  書面記錄文件的管理：

4.1.1 本實(shí)驗室的書面記錄包括：

001 ABCD人民醫(yī)院檢驗科基因檢測實(shí)驗室平面圖------------編號ABCD/001

002實(shí)驗室主要負(fù)責(zé)人簡歷表-----------------------------編號ABCD/002

003PCR實(shí)驗室工作人員一覽表----------------------------編號ABCD/003

004PCR擴(kuò)增接收標(biāo)本記錄表------------------------------編號ABCD/004

005拒收標(biāo)本記錄本-------------------------------------編號ABCD/005

006標(biāo)本超低溫保存記錄表-------------------------------編號ABCD/006

007PCR試劑購買記錄表----------------------------------編號ABCD/007

008試劑驗收記錄表-------------------------------------編號ABCD/008

009PCR室特殊耗材驗收記錄表----------------------------編號ABCD/009

010普通耗材驗收記錄表---------------------------------編號ABCD/010

011室間質(zhì)評記錄表-------------------------------------編號ABCD/011

012PCR室內(nèi)質(zhì)控記錄表----------------------------------編號ABCD/012

013室內(nèi)質(zhì)控圖-----------------------------------------編號ABCD/013

014 PCR實(shí)驗室環(huán)境溫濕度記錄表-------------------------編號ABCD/014

015冰箱溫度質(zhì)控圖-------------------------------------編號ABCD/015

016儀器使用記錄表-------------------------------------編號ABCD/016

017儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表---------------------------編號ABCD/017

018紫外消毒車消毒記錄表-------------------------------編號ABCD/018

019應(yīng)急處理登記表-------------------------------------編號ABCD/019

020 PCR廢血標(biāo)本處理交接表-----------------------------編號ABCD/020

021垃圾處理記錄表-------------------------------------編號ABCD/021

022實(shí)驗室清潔消毒記錄表-------------------------------編號ABCD/022

023 PCR檢驗報告單-------------------------------------編號ABCD/023

024耗材進(jìn)購記錄表-------------------------------------編號ABCD/024

025試劑耗材供應(yīng)商一覽表-------------------------------編號ABCD/025

4.1.2 填寫書面記錄，需使用黑色墨水或圓珠筆，字跡清晰，如有涂改，在涂改處應(yīng)有涂改人簽名，不得在記錄表上進(jìn)行無關(guān)書寫，保持記錄表清潔、完整。實(shí)驗記錄表嚴(yán)格專用，不同實(shí)驗區(qū)不得混用。

4.1.3 每個記錄本要納入檔案管理，寫完后及時放入檔案柜，每月分類裝訂成冊,并依照要求進(jìn)行編號,如2003年5月的實(shí)驗結(jié)果記錄本、試劑消耗記錄本、室內(nèi)質(zhì)控圖分別編為200305SYJG、200305SJXH、200305SLZK，分別放于檔案柜的不同位置以便查詢。標(biāo)本原始檢測申請單最后保存于倉庫2年，其它實(shí)驗記錄保存于各自實(shí)驗操作區(qū)內(nèi)，保存5年。

4.1.4 定期對保存的記錄進(jìn)行分析總結(jié)，形成總結(jié)報告，以便改進(jìn)工作。

4.1.5 在沒有實(shí)驗室職責(zé)同意的情況下，不得隨意將記錄借出。在記錄借出時需有實(shí)驗室職責(zé)、經(jīng)手人、借閱人的簽名方可。

4.2 電腦上記錄文件的管理

4.2.1記錄文件必須保存在非系統(tǒng)分區(qū)中，如D盤，保存路徑要清晰、便捷、易查找。

4.2.2文件夾目錄結(jié)構(gòu)要求層次分明，一整年的實(shí)驗結(jié)果均保存在一個年度文件夾里，如“2003年”文件夾；每個年度文件夾包含12個月文件夾，如“Jan01”、“Feb02”，每天的實(shí)驗結(jié)果就保存在當(dāng)月文件夾里。

4.2.3 實(shí)驗文件保存時以當(dāng)天日期命名，若某天進(jìn)行了多, 次實(shí)驗，命名時在后面以a、b、c等字母標(biāo)識，如2003年5月8日做的兩次實(shí)驗，分別保存為20030508a和20030508b。

4.2.4為了防止儲存實(shí)驗結(jié)果的電腦發(fā)生系統(tǒng)崩潰、硬件故障等問題導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)果丟失、無法查詢等情況，每個月的實(shí)驗結(jié)果記錄文件都要用移動存儲設(shè)備（如軟盤、USB硬盤等）拷貝到另一部PC機(jī)上做備份；一年的數(shù)據(jù)要用刻錄機(jī)刻制一張CD光盤備份儲存，貼上標(biāo)簽，如“2003年實(shí)驗結(jié)果備份”,放入檔案柜妥善存放。

PCR應(yīng)急處理程序

1．目的：在實(shí)際工作中，儀器設(shè)備發(fā)生故障、試劑盒發(fā)生質(zhì)量問題時，為保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時，應(yīng)正確采取應(yīng)急措施，最大程度上避免或減輕不利影響。

2．適用范圍：適用于滿足核酸擴(kuò)增熒光檢測實(shí)驗室檢測需要并可能對檢驗結(jié)果造成誤差的儀器設(shè)備和試劑盒。

3．負(fù)責(zé)人：

4．細(xì)則：

4．1 核酸擴(kuò)增熒光檢測實(shí)驗室工作人員在職責(zé)范圍內(nèi)均有責(zé)任熟悉各種儀器和相關(guān)設(shè)備的性能、要求、維護(hù)和保養(yǎng)、常見故障的排除、尤其要嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作。

4．2 工作人員在職責(zé)范圍內(nèi)均有責(zé)任有意識地注意以求及時發(fā)現(xiàn)并報告儀器設(shè)備和試劑盒的異常情況。

4．3 作為應(yīng)急處理，潛在著一定的可能影響檢測質(zhì)量的不確定因素。室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)在第一時間檢查核實(shí)應(yīng)急措施的有效性。

4．4 儀器設(shè)備故障

4．4．1 室負(fù)責(zé)人接到異常情況報警后，立即現(xiàn)場確認(rèn)異常情況的性質(zhì)：觀察有誤、誤操作、偶發(fā)現(xiàn)象或確屬不能立即排除的故障。

4．4．2 用紅牌故障標(biāo)志標(biāo)示故障儀器，以防被錯誤使用。

4．4．3有滿足要求的替用設(shè)備的，啟用替用設(shè)備（準(zhǔn)用儀器）。借用其他部門儀器設(shè)備時，及時聯(lián)系借用并核實(shí)該設(shè)備的使用狀態(tài)。替用、借用或備用設(shè)備的使用在滿足質(zhì)量要求的同時，必須同時滿足實(shí)驗室管理措施（特別是防污染）的要求。

4．4．4不能解決的問題，應(yīng)及時與供應(yīng)方會同解決。根據(jù)雙方合同約定，及時通知供應(yīng)方。供應(yīng)方技術(shù)支持人員將在規(guī)定的時間內(nèi)隨身攜帶備用設(shè)備到達(dá)現(xiàn)場。

4．4．5儀器維修后，必須經(jīng)驗收合格并供需雙方簽字，調(diào)試實(shí)驗通過后才能重新啟用。取下紅色故障標(biāo)示（暫停使用），換上藍(lán)色正常標(biāo)示（正常使用）。

4．4．6 室主任須檢查并隨時跟蹤所采取措施的有效性。

4．4．7對未能及時排除故障時，必須及時上報科室，在科主任批準(zhǔn)下，應(yīng)積極聯(lián)系附近的其他已得到衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證的臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室檢驗，以滿足病人和臨床或科研需求。

4．5 試劑盒質(zhì)量發(fā)生問題，經(jīng)核實(shí)后，及時通知供貨商迅速更換另一批次試劑，使用前需先作質(zhì)量檢測，合格后方可使用。

4．6 儀器設(shè)備故障或試劑質(zhì)量問題不能得到解決，預(yù)期將會影響到檢測報告的及時發(fā)出，可將標(biāo)本送至其它已得到衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證的臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室檢查；如已影響到報告的及時發(fā)出，應(yīng)在門診取報告處向病人公告或向相關(guān)病區(qū)公告，取得病人的諒解。

4．7  影響到檢測報告發(fā)出的情況，應(yīng)在應(yīng)急處理記錄表作記錄。

5. 本文涉及以下表格：

應(yīng)急處理記錄表        

試劑的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1．目的：保證每批用于臨床實(shí)驗的試劑的質(zhì)量良好，符合要求。

2．適用范圍：各種用于臨床實(shí)驗的核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑（HBV、HCV、TB、CT）。

3．負(fù)責(zé)人：      操作人：

4．程序：

4．1 收到試劑后，目測試劑是否處在凍存狀態(tài)。

4．2 核對試劑品種和數(shù)量并檢查包裝：外包裝（廠名廠址、、批準(zhǔn)文號、批號和有效期等）；內(nèi)包裝（試劑瓶完整性、試劑配備品種完整性、使用說明書有否等）。

4．3 及時將試劑轉(zhuǎn)入－20℃冰箱保存。將上述檢測核對情況在記錄本上登記。

4．4 最遲在前批次試劑存量尚可維持常規(guī)實(shí)驗一周時，按如下要求對新批號試劑進(jìn)行效驗實(shí)驗。

4．5 效驗實(shí)驗：

4．5．1 要求設(shè)置：空白對照、陰性對照、陽性對照、室內(nèi)質(zhì)控各一，陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度（10⁴、10⁵、10⁶、10⁸）。

4．5．2 出現(xiàn)如下情況中任何一種的，判斷為試劑不合格，不能用于臨床檢測：

a）空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增。如擴(kuò)增曲線CT值大于25，需重復(fù)實(shí)驗確證試劑污染。

b）陽性對照和陽性標(biāo)準(zhǔn)品均未檢出，或陽性對照未檢出而陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。

4．5．3 陽性對照未檢出，陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測正常，提示樣品提取液可能存在問題。重復(fù)新舊提取液陽性對照實(shí)驗，確定提取液失效問題。更換提取液后該批試劑方可使用。

4．5．4 空白對照無擴(kuò)增，陰性對照有擴(kuò)增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。單獨(dú)用提取液點(diǎn)樣上機(jī)，出現(xiàn)擴(kuò)增，需更換提取液后方可使用該批試劑。

4．5．5 陽性對照檢出，陽性標(biāo)準(zhǔn)品未檢出或擴(kuò)增曲線明顯系統(tǒng)性CT值偏大5個循環(huán)以上。提示陽性標(biāo)準(zhǔn)品存在問題。更換陽性標(biāo)準(zhǔn)品后該批試劑方可投入使用。

4．5．6空白對照、陰性對照無擴(kuò)增，陽性對照正常檢出，陽性標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相關(guān)性（﹤－0.99）均在使用范圍內(nèi)，表明該批試劑良好，可以投入臨床使用。

4．6 將實(shí)驗結(jié)果歸入記錄。

5.      本文涉及以下圖表

PCR試劑購買記錄表         

試劑驗收記錄表

PCR消耗品進(jìn)購、質(zhì)檢、貯存程序

1、目的：保證實(shí)驗消耗品的質(zhì)量、合理配用及存放

2、范圍： 1.5ml離心管、0.5ml離心管、帶濾芯的吸頭

3．負(fù)責(zé)人：        操作人：

4、程序：

4.1實(shí)驗人員按需提出所購耗材的品名、規(guī)格、數(shù)量，交科主任審核，報相關(guān)部門訂貨及購買。

4.2 消耗品進(jìn)購后經(jīng)質(zhì)檢合格方可入倉，填寫消耗品進(jìn)購、質(zhì)檢記錄表。

4.3無菌處理前的消耗品貯存于試劑貯存、準(zhǔn)備區(qū)，定期領(lǐng)取消毒并作用量記錄，消毒過的消耗品送標(biāo)本制備區(qū)備用。

4.4消耗品在使用過程中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題（如畸形、離心管密閉性不好等），立即通知科主任，科主任報相關(guān)部門，辦理退、換貨手續(xù)。

5、質(zhì)檢

5.1  0.5ml、 1.5ml離心管

5.1.1   目測:檢查離心管有無畸形、破損、不能閉蓋的情況。

5.1.2   實(shí)驗檢測：

（1）目測合格后，隨機(jī)抽取50個離心管用于實(shí)驗檢測。

（2）離心管置于干式恒溫器中20分鐘后取出，如發(fā)現(xiàn)有爆開情況發(fā)生，即認(rèn)為該批離心管不符合本實(shí)驗室實(shí)驗要求，作退貨處理。

（3）再將這50個離心管加半量生理鹽水后，10000rpm離心20分鐘，如發(fā)現(xiàn)有管蓋爆開或漏液情況發(fā)生，即認(rèn)為該批離心管不符合本實(shí)驗室實(shí)驗要求作退貨處理。

（4）用6個離心管做平行對照實(shí)驗，是否與預(yù)期結(jié)果一致。

（5）經(jīng)上述檢測合格后，即啟用該批耗材。

5.2  檢測帶濾芯的吸頭

5.2.1 目測：檢查吸頭有無畸形、破損，是否帶有濾芯。

5.2.2   實(shí)驗檢測：

（1）目測合格后，隨機(jī)抽取50個吸頭用于實(shí)驗檢測。用適配加樣器配合吸取適量液體，檢查有無吸孔堵塞、漏氣現(xiàn)象發(fā)生，在排除移液器因素后，如有異常發(fā)現(xiàn)，即認(rèn)為該批吸頭不符合本實(shí)驗室實(shí)驗要求，作退貨處理。

（2）用10個濾芯吸頭做平行對照實(shí)驗，是否與預(yù)期結(jié)果一致。

（3）經(jīng)上述檢測未發(fā)現(xiàn)不合格情況后，即啟用該批耗材。

6.  本文涉及以下圖表

耗材進(jìn)購記錄表                       

PCR室特殊耗材驗收記錄表               

普通耗材驗收記錄表                   

PCR室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1．目的：隨時了解并控制實(shí)驗室檢測的精密度變化。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光定量檢測實(shí)驗室。

3．負(fù)責(zé)人：       操作人：

4．程序：

4．1血清質(zhì)量控制品制備及操作

4．1．1質(zhì)控品制備：

收集本室檢測的臨床樣本，HBV DNA定量為10⁶copies/ml的樣本混勻，并分裝于0.5ml的離心管中，每支110µl，編號后（如Qb0201-n），-20℃保存。

4．1．2 操作：

每次檢測過程中將此分裝的室內(nèi)質(zhì)控品與樣本同時檢測，記錄此標(biāo)本的檢測結(jié)果；計算前10次檢測結(jié)果的平均值作為本批質(zhì)控品的靶值。

4．1．3如果使用商品化的質(zhì)控品，按4．１．２要求執(zhí)行。

4．2 室內(nèi)質(zhì)控圖的使用方法

4．2．1 描點(diǎn)

a） 圖中 線為靶線， ±2s為警告線， ±3s為失控線。

對于同一批號的質(zhì)控血清不論使用幾個月，其空圖均不變化。只要將圖紙上方“起止日期”項填入每個月的實(shí)際起止日期即可。

b） 每天將該批號質(zhì)控血清按有關(guān)規(guī)定程序復(fù)融隨同病人的標(biāo)本同時檢測。將日期、檢測結(jié)果和操作者如實(shí)記錄在圖下方的相應(yīng)位置，并按前面的方法畫出圖上的對應(yīng)點(diǎn)，用直線將該點(diǎn)與前一天的點(diǎn)連接。

c）月底計算當(dāng)月全部質(zhì)控血清檢測結(jié)果的 、s和CV，并進(jìn)行圖形分析和小結(jié)，將質(zhì)量控制圖存入質(zhì)控資料檔案。

4．2．2 圖形分析

a）如果在 ±3s線以外，則為失控，應(yīng)立即報告有關(guān)負(fù)責(zé)人，迅速查找原因。必要時復(fù)測標(biāo)本，然后方可發(fā)出報告，并將失控情況、查找過程及處理結(jié)果等詳細(xì)記錄。

b）如果在 ±2s線以外，或出現(xiàn)連續(xù)6點(diǎn)以上在一側(cè)等規(guī)律變化，均應(yīng)即使向有關(guān)負(fù)責(zé)人反映，并積極查找原因。但當(dāng)天的檢驗結(jié)果一般可以發(fā)出。

4．2．3 通過觀察圖形的規(guī)律性變化進(jìn)行誤差分析，消除誤差來源

a）曲線漂移：提示有系統(tǒng)誤差，準(zhǔn)確度發(fā)生了一次性的向上或向下改變。這種變化往往是由于一個新的情況引起的。如更換不同批號試劑，啟用新批號的質(zhì)控血清、操作人員的變換等。在找原因時，應(yīng)重點(diǎn)注意“漂移”前后發(fā)生了那些變動的因素。

b）趨勢性變化：向下或向上的趨勢性變化表明檢測的準(zhǔn)確度發(fā)生了漸漸地變化。這種變化往往是由于一個逐漸改變的因素造成的。如質(zhì)控血清的降解，試劑效價的降低等。

c）連續(xù)多點(diǎn)分布在靶值一側(cè)：目前，一般認(rèn)為質(zhì)控血清的檢測結(jié)果連續(xù)6天以上

出現(xiàn)在靶值同一側(cè)，則應(yīng)迅速查找原因，爭取盡快使之回復(fù)圍繞在靶值隨機(jī)分布的狀態(tài)。因為按照統(tǒng)計學(xué)原理，由純隨機(jī)誤差造成的這種情況的可能性很小。連續(xù)6天以上出現(xiàn)在靶值同一側(cè)可能性小于1.5％。因此凡出現(xiàn)連續(xù)6天以上出現(xiàn)在靶值同一側(cè)者均有可能存在非隨機(jī)誤差因素。如結(jié)果與靶值偏離并不太大，不會給臨床使用帶來太大影響時，一般檢驗報告可以照常填發(fā)。

d）其他規(guī)律變化：（周期性等）

4．2．4 通過圖形的資料對比進(jìn)行誤差分析，消除誤差來源

a）每個月的月底將該月的全部質(zhì)控血清檢測結(jié)果的 和s與該批測定的 和s進(jìn)行比較。如果 發(fā)生了變化，說明準(zhǔn)確度發(fā)生了變化提示有非隨機(jī)誤差存在。如果當(dāng)月s不同則表明檢測的精密度發(fā)生了變化。

b）將使用同一批號質(zhì)控血清的CT值的 和s按月份列出。如果 逐月上升， 應(yīng)考慮保存不當(dāng)造成的試劑效價降低或質(zhì)控血清本身出現(xiàn)降解。如果各月份 基本一致而s逐月加大，則主要提示常規(guī)工作的精密度下降，應(yīng)重點(diǎn)從操作、管理上找原因。

c）在數(shù)年中，把每個月的CV和失控規(guī)律列成表，可用作檢測質(zhì)量的歷史性回顧及趨勢分析。

5. 本文涉及以下圖表：

PCR室內(nèi)質(zhì)控記錄表          

室內(nèi)質(zhì)控圖                

PCR室間質(zhì)量控制操作程序

1．目的：室間質(zhì)評（EQA）是實(shí)驗室質(zhì)量控制體系中重要部分，是保證患者檢驗結(jié)果和其報告的準(zhǔn)確性和可靠性，以及各實(shí)驗室間結(jié)果的可比性的重要手段。

2．適用范圍：衛(wèi)生部或省臨檢中心下發(fā)的PCR室間質(zhì)控血清檢測。

3．負(fù)責(zé)人：     操作人：

4．程序：

4.1質(zhì)控標(biāo)本的接收和驗收：收到質(zhì)控血清后由相關(guān)人員登記、簽字，根據(jù)質(zhì)控標(biāo)本的有關(guān)說明對血清的數(shù)量、批號、包裝進(jìn)行驗收并將質(zhì)控標(biāo)本按要求置-20℃保存于標(biāo)本制備區(qū)。

4.2 質(zhì)控標(biāo)本的檢測按常規(guī)臨床標(biāo)本對待，若需要，檢測前先根據(jù)說明對質(zhì)控物進(jìn)行復(fù)溶。

4.3室間質(zhì)評樣本必須按實(shí)驗室常規(guī)工作進(jìn)行，由進(jìn)行常規(guī)工作的人員測試，工作人員必須使用實(shí)驗室的常規(guī)檢測方法和試劑，不得特殊對待。檢測結(jié)果須在截止日期前上報。

4.4實(shí)驗室檢測EQA樣本的次數(shù)必須與常規(guī)檢測病人樣本的次數(shù)一樣（即1次）。

4.5   EQA樣本的檢測在部或省臨檢中心規(guī)定的時間內(nèi)進(jìn)行，檢測結(jié)果的上報也必須在截止  日期前，通過E-mail或掛號信寄出。

4.6室間質(zhì)評的檢測結(jié)果和反饋結(jié)果均記錄于室間質(zhì)評記錄表，根據(jù)反饋結(jié)果分析室間質(zhì)評的狀態(tài)，如有出控應(yīng)查找原因，并采取相應(yīng)的措施。

4.7 嚴(yán)禁與其它實(shí)驗室交流室間質(zhì)評的檢測結(jié)果。

5. 本文涉及以下圖表：

室間質(zhì)評記錄表      

溫度校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、目的： 保證實(shí)驗時溫度的準(zhǔn)確

2、范圍： 基因擴(kuò)增實(shí)驗室所有溫控的儀器

3．負(fù)責(zé)人：       操作人：

4、程序

4.1溫度計校準(zhǔn)程序：

4.1.1 由設(shè)備科人員送質(zhì)檢局對溫度計進(jìn)行校準(zhǔn)。每年進(jìn)行1次。

4.1.2經(jīng)校準(zhǔn)過的溫度計可作為微量恒溫器溫度校溫的參照。

4.2 水浴箱溫度校準(zhǔn)程序：

4.2.1 將水浴箱調(diào)至所設(shè)置的溫度，等水溫穩(wěn)定以后，進(jìn)行測量。

4.2.2 取出一只已經(jīng)技術(shù)監(jiān)督局校準(zhǔn)后的溫度計進(jìn)行測量。

4.2.3 計下讀數(shù)，重復(fù)在不同溫度下測量。

4.2.4 經(jīng)測量的溫度和水浴箱顯示溫度進(jìn)行比較，計算出誤差。

4.2.5 將水浴箱調(diào)至校準(zhǔn)后的溫度。

4.2.6 每次試驗前都必須進(jìn)行此項工作。

4.3  冰箱溫度的校準(zhǔn)：（4℃冰箱和—20℃冰箱）

4.3.1 每次實(shí)驗前都需對冰箱溫度進(jìn)行記錄，繪置冰箱溫度的質(zhì)控圖。

4.3.2 取一只已經(jīng)技術(shù)監(jiān)督局校準(zhǔn)后的溫度計對冰箱溫度進(jìn)行實(shí)際測量，并計下讀數(shù)。

4.3.3 反復(fù)多次測量，如超出規(guī)定范圍，將冰箱調(diào)至所需溫度。

4.4 擴(kuò)增儀溫度的校準(zhǔn)

4.4.1 將擴(kuò)增儀打開并設(shè)至一溫度。

4.4.2 在擴(kuò)增儀的溫控孔入放一個反應(yīng)管，待溫度長至所設(shè)溫度時，用一只已經(jīng)持術(shù)監(jiān)督局校準(zhǔn)過和溫度計插入反應(yīng)管中進(jìn)行測量溫度并記錄。

4.4.3 在不同溫度點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)測量，取均值，并與擴(kuò)增儀的顯示溫度進(jìn)行比較。

4.4.4 由于儀器較精密，溫度相差太大則需請廠家前來校準(zhǔn)并調(diào)試。

4.4.5 經(jīng)調(diào)試后貼上綠色標(biāo)簽，標(biāo)明時間儀器的性能狀態(tài)。

5.      本文涉及以下圖表

PCR實(shí)驗室環(huán)境溫濕度記錄表         

冰箱溫度質(zhì)控圖                     

PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光儀操作維護(hù)程序

1．目的：使PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀能夠正確和正常的使用，保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。

2．適用范圍：PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀。

3．負(fù)責(zé)人：        操作人：

4.  性能參數(shù):見說明書。

5. 操作程序：

5．1 擴(kuò)增反應(yīng)前須先在PE5700 SDS 軟件的設(shè)置面板上按照事先排好的標(biāo)本位置進(jìn)行設(shè)置。每次實(shí)驗除了待檢標(biāo)本，還要包括一個陰性對照、一個陽性對照、一個陽性室內(nèi)質(zhì)控品、一組陽性標(biāo)準(zhǔn)品（4個梯度10⁴、10⁵、10⁶、10⁸）。

5．2 依次打開電腦顯示器和電腦主機(jī)的電源開關(guān)，進(jìn)入Windows NT界面。

5．3 接著打開光源檢測器和PCR儀電源開關(guān)，預(yù)熱5分鐘。 

5．4 點(diǎn)擊PE 5700 SDS 圖標(biāo)，打開軟件。

5．5 在New plate Application 窗口分別選定5700/SYBR Green， 然后單擊OK，打開一空白設(shè)置面板。

5．6 在Setup 版面設(shè)定樣品種類與名稱，數(shù)量。

5．6．1 在Type欄中選擇類別：STND－標(biāo)準(zhǔn)梯度，UNKN－未知樣品，

                             NTC－陰性對照，Not in use－未使用

5．6．2 再在Name欄中依次輸入樣品名稱。

5．6．3 在框定所選標(biāo)準(zhǔn)梯度孔數(shù)后，需在工具欄中單擊P窗口，選定PR1 primer SYBR后，關(guān)閉窗口，可見所選孔左下角有一長方形陰影。

5．6．4 在框定所選孔數(shù)后，在工具欄中單擊Q窗口，即可在此窗口輸入定值標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)量。

5．7 點(diǎn)擊Instrument 即可在此窗口設(shè)定循環(huán)參數(shù)。

5．8 選定任務(wù)欄File中的Save項，彈出對話框。在對話框中的File Name項下輸入一組數(shù)字和（或）字母組成的文件名，選Save。

5．9 檢查設(shè)置正確與否，運(yùn)行程序

5．9．1 在設(shè)置完程序文件的Instrument窗口，點(diǎn)RUN鍵，即可運(yùn)行。

5．9．2 反應(yīng)結(jié)束后，選任務(wù)欄File中的Save項，保存實(shí)驗結(jié)果。

5．10 關(guān)閉PE 5700 序列檢測器開關(guān)，再關(guān)擴(kuò)增儀開關(guān)。

5．11 結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)程序：

對于5700結(jié)果曲線的分析，應(yīng)按以下步驟進(jìn)行：全部曲線——陰性對照——陽性對照——陽性室內(nèi)質(zhì)控品——陽性標(biāo)準(zhǔn)品——逐個分析（標(biāo)出陽性標(biāo)本和可疑標(biāo)本）——調(diào)整參數(shù)，獲得較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示定量結(jié)果——登記，發(fā)報告。

5．11．1 整體曲線的觀察,將所有曲線選中進(jìn)行整體觀察.

a)觀察是否存在污染情況（包括標(biāo)本污染和試劑污染），特別應(yīng)注意大量曲線在同一Ct值出現(xiàn)上漲的情況。

b)觀察是否有光路傳導(dǎo)阻滯或電壓波動等機(jī)器原因形成的異常曲線。

5．11．2 陰性對照的分析

陰性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陰性標(biāo)本。

作用：用以監(jiān)測實(shí)驗室和前處理過程中是否存在污染。

5．11．3 陽性對照的分析

陽性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陽性標(biāo)本。

作用：用以監(jiān)測實(shí)驗?zāi)芊裾�常檢出陽性標(biāo)本，避免假陰性的出現(xiàn)。

5．11．4 陽性室內(nèi)質(zhì)控品的分析

陽性室內(nèi)質(zhì)控品：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知或未知濃度的陽性室內(nèi)質(zhì)控血清。

作用：用以監(jiān)控日常實(shí)驗的精密度。

5．11．5 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的分析

a)各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋可能存在問題，提示實(shí)驗中存在較大人為誤差。

b)觀察各曲線的Ct值是否在平日的正常位置：

情況1：若出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而各曲線Ct 值均后移，則判斷是否為試劑擴(kuò)增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。

情況2：出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標(biāo)準(zhǔn)品的降解情況。

c) 每日必做10²標(biāo)準(zhǔn)品，用作以下三方面監(jiān)控：

一 是否存在操作誤差，如加樣量過少等原因?qū)е?0²標(biāo)準(zhǔn)品未能檢出；

二 是否存在稀釋后的梯度放置過久，低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品降解的情況；

三 若高拷貝標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)Ct值后移，且能排除情況A、B，則判斷是否為試劑靈敏度下降。

5．11．6 單個曲線的判斷

逐個分析每條曲線，判斷曲線的陰陽性或?qū)倏梢汕�線。（可疑標(biāo)本是指曲線在27個Ct值后出現(xiàn)上漲且平臺趨勢不明顯或上漲幅度比較低的標(biāo)本�？梢蓸�(biāo)本要第二天重做，兩次結(jié)果一致則報陽性，否則結(jié)果報陰性。）曲線觀察內(nèi)容：在基線選擇2～8時觀察△Rn值大�。ㄊ欠裼腥�期特征）。在基線選擇0～0時觀察Rn值曲線形狀。

5．11．7 得出定量結(jié)果

調(diào)節(jié)基線和閾值以得到一較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。電腦據(jù)此曲線給出陽性結(jié)果值。此時應(yīng)排除某些陰性標(biāo)本因熒光曲線假性上揚(yáng)而得出的假陽性結(jié)果和某些弱陽性標(biāo)本因終末熒光值過低而顯示的假陰性。

5．11．8發(fā)放報告

及時登記檢測結(jié)果記錄，發(fā)放臨床報告。

5.12.維護(hù)和校準(zhǔn)程序：

5.12．1 微軟Windows NT工作站的維護(hù)

硬盤驅(qū)動器每月29日左右運(yùn)行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或類似軟件。具體步驟：

a）放入Norton Utilities光盤。

b）從My Computer打開Norton Utilities軟件光盤。

c）啟動清理碎片/優(yōu)化程序。

d）運(yùn)行完成后，檢查以確信無嚴(yán)重錯誤記錄，退出Norton Utilities。

e）取出Norton Utilities光盤，重新啟動計算機(jī)。

5.12．2  PCR儀的維護(hù)

5.12．2．1 樣品槽的清潔

樣品槽每月進(jìn)行一次清潔，如出現(xiàn)樣品槽污染情況則隨時清潔。

操作方法：

a）運(yùn)行25℃HOLD程序使樣品槽溫度達(dá)到室溫。關(guān)閉儀器，等待10分鐘。

b）從樣品槽移去樣品架。

c）在樣品槽中加入少量濃度≥95%乙醇，用尼龍棉簽或塑料桿擦洗反應(yīng)孔。

d）用干棉簽吸干乙醇。

e）在PE 5700光源檢測器未蓋住樣品槽時，打開PCR儀，并升溫到50℃運(yùn)行10分鐘，以蒸發(fā)掉多余的乙醇。

5.12．2．2  熱蓋的清潔

熱蓋每月進(jìn)行一次清潔，如有需要隨時進(jìn)行。

a）運(yùn)行25℃HOLD程序使樣品槽溫度達(dá)到室溫。關(guān)閉儀器，等待10分鐘。

b）逆時針旋轉(zhuǎn)PE 5700光源檢測器頂部旋鈕。向后推PE 5700光源檢測器至滑軌距離的大約1/3處。

c）PE 5700光源檢測器滑軌上有缺口。從這些缺口垂直抬起PE 5700光源檢測器，小心側(cè)放于儀器頂蓋上。不要從儀器取走熱蓋。

d）用經(jīng)過濃度≥95%乙醇濕潤的鏡頭紙或脫脂棉球清潔加熱蓋，待干。

e）將PE 5700光源檢測器重新安裝回滑軌。

5.12．2．3  PE 5700光路系統(tǒng)的維護(hù)

5.12．2．3．1  調(diào)準(zhǔn)ROI參照條

調(diào)準(zhǔn)ROI參照條在儀器更換鹵素?zé)�、儀器定期校準(zhǔn)或儀器維修后進(jìn)行。不得由一般實(shí)驗人員進(jìn)行該項操作。

a）PCR儀樣品槽中放入熒光檢測板。

b）將PE 5700光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。

c）從Start菜單選擇運(yùn)行PE 5700 SDS管理軟件。

d）積分時間從512ms開始，用位置調(diào)整點(diǎn)，調(diào)節(jié)ROI的高度與右邊線。

e）逐漸增加積分時間，直到可以看到至少四個塊（約4096ms）。

f）調(diào)整最左側(cè)位置調(diào)整點(diǎn)。

g）減少積分時間到1024ms，調(diào)整上方與底部的位置調(diào)整點(diǎn)。

h）減少積分時間以便最右側(cè)塊可見但未飽和（約512ms），調(diào)節(jié)最右側(cè)位置調(diào)整點(diǎn)。如有需要用右上角拖動點(diǎn)調(diào)整圖像的傾斜度（以左上角為中心旋轉(zhuǎn)）。

i）調(diào)節(jié)后的參照條寬度必須在ROI參照塊間有小空隙。

5.12．2．3．2  校正ROI光路

ROI光路校正每月進(jìn)行一次，以便確信結(jié)果仍然是優(yōu)化的。

a）在PCR儀樣品槽中放入熒光檢測板。

b）將PE 5700光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。

c）從Start菜單選擇運(yùn)行PE 5700 SDS管理軟件。

d）點(diǎn)選Show ROI復(fù)選框。每個樣品孔周圍出現(xiàn)一藍(lán)色橢圓圈。

e）點(diǎn)選Show Saturation復(fù)選框。

f）設(shè)定積分時間為1024ms；打開鹵素?zé)艉凸忾l。

g）點(diǎn)擊LIVE按鈕獲取圖像，然后在任何地方左擊停止。獲取中等程度未飽和圖像（無紅色圖像）。

h）從Edit菜單中選擇Calibrate ROIs每個孔都會選取合適的ROI，確定96孔都被藍(lán)色橢圓圈正確界定。

i）圖像太亮太暗都會出現(xiàn)錯誤信息，相應(yīng)增加或減少積分時間，并重復(fù)上述第8步直到無錯誤信息出現(xiàn)。

j）檢查孔ROI位置，所有孔信息都應(yīng)包含在96個ROI橢圓圈中。如果沒有，重復(fù)8和9步。

5.12．2．3．3  檢查PCR儀樣品槽的熒光污染

檢查PCR儀樣品槽的熒光污染每月進(jìn)行一次，如有需要隨時進(jìn)行。

a）開啟PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀電源。

b）從Start菜單選擇運(yùn)行PE 5700 SDS管理軟件。

c）從樣品槽中移去反應(yīng)板。

d）將PE 5700光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。

e）設(shè)定積分時間為256ms；打開鹵素?zé)艉凸忾l。

f）點(diǎn)擊LIVE按鈕獲取圖像，然后在任何地方點(diǎn)擊停止。

g）觀察96孔中背景熒光。如孔有顯著熒光則表示該孔存在熒光污染。

h）按照樣品槽的清潔程序清洗樣品槽。

5.12．2．3．4  更換鹵素?zé)?/P>

儀器使用大約2000小時后應(yīng)更換鹵素?zé)?但具體要視鹵素?zé)魧?shí)際情況而定。

a）關(guān)閉PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀，冷卻15分鐘。

b）移去PE 5700光源檢測器頂蓋。

c）移去鹵素?zé)繇斏w。

d）把舊燈泡從插座中滑出，更換新鹵素?zé)�。確信燈正確安裝在位置上�；瑒訜襞輹r要輕輕抬起燈以避開裝配螺絲釘。

e）重新裝上燈頂蓋和PE 5700光源檢測器頂蓋。

f）開啟PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀電源，運(yùn)行PE 5700 SDS管理軟件。

g）通過軟件控制鹵素?zé)糸_關(guān)，確認(rèn)燈隨開關(guān)開閉。

h）開啟光閘，確認(rèn)光閘可打開。

i）設(shè)定積分時間為1024ms，點(diǎn)擊LIVE。保證可以采集一幅數(shù)據(jù)圖像。

j）若新鹵素?zé)舨还ぷ�，PE 5700電源保險管可能有問題。

5.12．3 校準(zhǔn)

PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀為復(fù)雜精密儀器，其校準(zhǔn)工作需由專業(yè)工程師進(jìn)行。實(shí)驗室應(yīng)與儀器廠家達(dá)成協(xié)議，定期（一般每年一次）校準(zhǔn)儀器。

平時通過對室內(nèi)質(zhì)控圖的分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)誤差后，又經(jīng)過分析排除了試劑和人員誤差，應(yīng)懷疑是否儀器出現(xiàn)了檢測偏差從而需要校準(zhǔn)。

實(shí)驗室人員根據(jù)上述“光路系統(tǒng)的維護(hù)”部分的內(nèi)容調(diào)節(jié)光路，可初步確定儀器是否光路原因引起的檢測偏差，通過光路調(diào)節(jié)解決問題。若問題不出在光路系統(tǒng)，則應(yīng)聯(lián)系儀器廠家派技術(shù)人員來進(jìn)行校準(zhǔn)。

注意事項：

a）儀器應(yīng)放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。

b）環(huán)境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。

c）儀器應(yīng)每月底清潔維護(hù)。

d）儀器使用時應(yīng)嚴(yán)格遵守上述使用步驟。

6. 期間核查

(1)PE-5700基因擴(kuò)增儀的定標(biāo)不需要特別的周期間隔，本實(shí)驗室PE-5700基因擴(kuò)增儀執(zhí)行衛(wèi)生部臨床檢驗中心的指定校準(zhǔn)。

(2) 校準(zhǔn)物均為與ICSH之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。

7 . 相關(guān)記錄

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀 器 設(shè) 備 總 表

干式恒溫器操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：正確使用、維護(hù)和校準(zhǔn)干式恒溫器。

2．適用范圍：干式恒溫器。

3．負(fù)責(zé)人：       操作人：

4. 技術(shù)參數(shù):見說明書。

5．程序：

5．1干式恒溫器應(yīng)置于堅固的水平臺上，電源電壓須匹配。

5．2 打開電源開關(guān)，設(shè)定溫度時間至所需溫度。

5．3 設(shè)定恒溫時間至所需時間。

5．4 當(dāng)測定溫度達(dá)到設(shè)定溫度時，加熱中斷、指示燈熄滅，測定溫度小于設(shè)定溫度時，指示燈亮，開始加熱，如此反復(fù)，溫度可保持穩(wěn)定。

5．5 每年校正溫度一次。

5．6 干式恒溫器波動范圍應(yīng)控制在：溫度 +/–1℃以內(nèi)。

5．7溫度誤差校準(zhǔn)

5．7．1本儀器出廠前溫度己校準(zhǔn)。但由于某些原因造成實(shí)際溫度與顯示溫度之間存在偏差，可按以下方法修正溫度誤差；

注意！為了保證溫度的準(zhǔn)確性，本儀器采用兩點(diǎn)溫度校準(zhǔn)法，即40℃與100℃兩點(diǎn)溫度同步線性校準(zhǔn)法。經(jīng)兩點(diǎn)溫度線性校準(zhǔn)后，系統(tǒng)保證其它溫度點(diǎn)的溫度準(zhǔn)確度≤±0.5℃。校準(zhǔn)溫度時環(huán)境溫度和模塊的溫度必須低于30℃。

5．7．2具體操作方法如下：

a)儀器開機(jī)后，進(jìn)入等待界面，此時觀察溫度顯示窗溫度，確認(rèn)其溫度值應(yīng)小于35℃。若溫度高于35℃，等溫度降至35℃后，按以下方法操作。

b)將石臘油注入模塊中心位置的一個錐形孔內(nèi)，并于錐形孔中放入溫度計（要求溫度計精度為0.1℃，溫度計感溫包必須完全浸入于錐形孔內(nèi)），模塊上部用隔熱材料于環(huán)境隔離。見下圖a.

c)  同時按下▲和  鍵，進(jìn)入溫度校準(zhǔn)界面，

此時，時間顯示窗顯示為：“ADLF”表示己進(jìn)入溫度校準(zhǔn)程序；溫度顯示窗顯示為即時溫度，并自動開始升溫至40.0℃

當(dāng)溫度升溫至40.0℃恒溫后,小數(shù)位開始閃爍,等待40℃的溫度校準(zhǔn)值。要求理溫20分鐘后，讀取溫度計的實(shí)測溫度。

注意！為保證溫度校準(zhǔn)精度，建議用戶于恒溫20分鐘后讀取實(shí)測溫度！

 若溫度計讀取的數(shù)值為39.6℃,則按“TEMP”和▲或  鍵于溫度顯示窗內(nèi)輸入39.6，按“R/S”鍵確認(rèn)輸入值。

d)接著儀器自動升溫至100℃，于100℃恒溫后等待輸入溫度校準(zhǔn)值。同樣要求恒溫20分鐘后，讀取溫度計的實(shí)測溫度。

注意！為保證溫度校準(zhǔn)精度，建議用戶于恒溫20分鐘后讀取實(shí)測溫度！

若溫度計讀取的數(shù)值為101.5℃，則按“TEMP”和▲或  鍵于溫度顯示窗內(nèi)輸入101.5，按“R/S”鍵確認(rèn)輸入值。

e)這樣兩點(diǎn)校溫己完成，同時按下▲和  鍵，退出溫度校準(zhǔn)界面，返回至等待界面。

注意！兩點(diǎn)溫度校準(zhǔn)過程中，同時按下▲和  鍵，則退出校溫程序，己修正的溫度值無效！

5．8 干式恒溫器內(nèi)外應(yīng)保持清潔，外殼忌用腐蝕性溶液擦拭。

5．9 儀器長期不用時，需防潮防塵保存。

6. 儀器維護(hù)

(1) 本儀器應(yīng)定期用干凈軟布沾少量無水酒精清冼模塊上的錐孔,以保證試管與錐孔壁接觸充分,導(dǎo)熱良好,避免污染。

(2) 本儀器表面如有污染,可用軟布沾清潔膏清冼。

(3) 該儀器在日常使用中請注意符合“5.”要求。

(4) 嚴(yán)格按照儀器的開關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。

6. 期間核查

(1) 干式恒溫器的定標(biāo)不需要特別的周期間隔。

(2) 每年必須校正溫度一次。

7 相關(guān)記錄：

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀 器 設(shè) 備 總 表

離心機(jī)操作維護(hù)程序

1．目的：保證離心機(jī)的正常使用。

2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機(jī)。

3．負(fù)責(zé)人：     操作人：

4. 性能參數(shù):見說明書。

5．程序：

5．1 離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅固的地板或平臺上，并力求使儀器處于水平位置以免離心時造成儀器振蕩。

5．2 打開電源開關(guān)，將預(yù)先平衡好的樣品對稱放置于轉(zhuǎn)頭的樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。

5．3 旋動定時旋鈕設(shè)定離心時間，緩慢旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕使儀器轉(zhuǎn)速達(dá)到預(yù)定要求。

5．4 離心完畢后，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零位，關(guān)閉電源開關(guān)。

5．5 待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動時打開機(jī)蓋，取出離心樣品，再次關(guān)閉機(jī)蓋結(jié)束離心。

5．6 離心室的清潔：為了避免樣本等殘留物的污染，應(yīng)經(jīng)常對離心機(jī)外殼和離心室進(jìn)行清潔處理。對離心室清潔，應(yīng)先打開離心機(jī)蓋，撥掉電源線，用專用設(shè)備將離心機(jī)轉(zhuǎn)子旋下，再用中性去污劑（70%的異丙醇/水混合物或乙醇去污染）清潔離心室；離心室內(nèi)的橡膠密封圈經(jīng)去污劑處理后，用水沖洗，再用甘油潤滑。

5．7 轉(zhuǎn)子的清潔：轉(zhuǎn)子會被樣本殘留物污染，也可能會被某些化學(xué)試劑腐蝕，因此應(yīng)對轉(zhuǎn)子每月進(jìn)行清潔維護(hù)。每月用中性的清潔劑清潔轉(zhuǎn)子一次，并在儀器維護(hù)記錄本上作好記錄，以延長轉(zhuǎn)子的壽命。

6. 儀器維護(hù)

(1) 為確保安全和離心效果,儀器必須放置在堅固水平的臺面上,塑料蓋門上不得放置任何物品,樣品必須對稱放置,并在開機(jī)前確保已擰緊螺母。

(2) 應(yīng)經(jīng)常檢查轉(zhuǎn)頭及試驗用的離心管是否有裂紋,老化等現(xiàn)象,如有須及時更換.

(3) 試驗完畢后,需將儀器擦拭干凈,以防腐蝕.

(4) 如樣品比重超過1.2g/cm³,最高轉(zhuǎn)速n按下式計算:n=nmax*√--1.2/樣呂比重.

(5) 當(dāng)電機(jī)碳刷長度小于6mm時,必須及時更換.

(6) 在離心機(jī)未停穩(wěn)時不得開蓋.

(7) 儀器必須有可靠接地.

(8) 實(shí)驗結(jié)束后,請關(guān)閉后面的電源開關(guān),撥掉電源插頭時,請不要忘了打開后面的電源開關(guān).

(9) 該儀器在日常使用中請注意符合“5.6,5.7”要求。

      (10) 嚴(yán)格按照儀器的開關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。

7. 期間核查

(1)本儀器不需要特別的周期間隔。

(2) 校準(zhǔn)物均為與ICSH之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。

8. 相關(guān)記錄

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀器設(shè)備總表

冰箱操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：對冰箱進(jìn)行適當(dāng)?shù)木S護(hù)，以確保冰箱的正常使用。

2．適用范圍：本實(shí)驗室使用的各種品牌、型號的冰箱。

3．負(fù)責(zé)人：      操作人：

4.  性能參數(shù):見說明書。

5．程序：

4．1  開、關(guān)機(jī)：冰箱按說明書要求放好后，插上電源線，冷藏室溫度開關(guān)置于4℃，冷凍室溫度開關(guān)置于 -20℃，2小時后用溫度計確認(rèn)。系統(tǒng)進(jìn)入正常運(yùn)行狀態(tài)后即可使用。

4．2 外冰箱應(yīng)放置于水平地面并留有一定的散熱空間。外接電源電壓必須匹配，并要求有良好的接地線。

4．3 冰箱內(nèi)禁止存放與本實(shí)驗室無關(guān)的物品。

4．4 放入冰箱內(nèi)的所有試劑、樣品、質(zhì)控品等必須密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通暢；非自動除霜冰箱應(yīng)在每月底除霜；月底清潔冰箱，清潔時切斷電源，用軟布蘸水擦拭冰箱內(nèi)外，必要時可用中性洗滌劑。

4．6 每日觀察冰箱內(nèi)溫度并記錄于冰箱的質(zhì)控圖上。

4．7 若溫度超出規(guī)定范圍，調(diào)節(jié)溫控使其回到正常范圍，并進(jìn)行記錄。    

4．8 若溫控調(diào)節(jié)無效，報請設(shè)備科維修，修理后須驗收合格并簽字后方能正常使用。

6. 儀器維護(hù)

(1) 使用注意。該儀器在日常使用中請注意符合“4. 注意事項”要求

(2) 廢液瓶滿要及時倒掉廢液，切勿強(qiáng)行扯動紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。

(3) 當(dāng)出現(xiàn)堵孔時，按自動沖洗鍵沖洗管道。

 (4) 嚴(yán)格按照儀器的關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。

7. 期間核查

(1冰箱不需要特別的周期間隔。

(2) 校準(zhǔn)物均為與ICSH之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。

8 . 相關(guān)記錄

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀 器 設(shè) 備 總 表

生物安全柜操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：正確使用生物安全柜。

2．適用范圍：本SOP適用于本實(shí)驗室使用的生物安全柜。

3．負(fù)責(zé)人：      操作人：

4.  性能參數(shù):見說明書。

5．程序：

5．1 新安裝或長期未使用的生物安全柜，使用前必須用超凈真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的物品認(rèn)真進(jìn)行清潔工作。5．2 接通電源，使用前應(yīng)提前15～30分鐘同時開啟紫外燈和風(fēng)機(jī)組工作。

5．3 當(dāng)需要調(diào)節(jié)風(fēng)機(jī)風(fēng)速時，用生物安全柜操作面板上的風(fēng)速調(diào)節(jié)鈕進(jìn)行調(diào)節(jié)。風(fēng)機(jī)、照明均由指示燈指示其工作狀態(tài)。

5．4 工作臺面上禁止存放不必要的物品，以保持工作區(qū)的潔凈氣流不受干擾。

5．5 禁止在工作臺面上記錄書寫，工作時應(yīng)盡量避免作明顯擾動氣流的動作；禁止在預(yù)過濾進(jìn)風(fēng)口部位放置物品，以免擋住進(jìn)風(fēng)口造成進(jìn)風(fēng)量減少，降低凈化能力。

5．6 使用結(jié)束后，用消毒液清理工作臺面后打開紫外燈，15～30分鐘后關(guān)閉紫外燈，關(guān)閉生物安全柜電源。每次使用生物安全柜后，均需對其進(jìn)行清潔。

5．7根據(jù)環(huán)境潔凈程度，定期將預(yù)過濾器中的濾料拆下清洗，一般間隔時間為3～6個月。

5．8定期（一般每半年1次）計測工作區(qū)風(fēng)速，如發(fā)現(xiàn)不符合技術(shù)參數(shù)要求，則可調(diào)大風(fēng)機(jī)供電電壓。當(dāng)風(fēng)機(jī)組電壓調(diào)到最大時，工作區(qū)風(fēng)速仍達(dá)不到0.3m/s，則必須更換高效空氣過濾器（由廠家或院儀器維修人員進(jìn)行）。4．9有相應(yīng)的維護(hù)記錄，長期不使用的生物安全柜撥下電源插頭。

6. 儀器維護(hù)

(1) 使用注意。該儀器在日常使用中請注意符合“4. 注意事項”要求

(2) 廢液瓶滿要及時倒掉廢液，切勿強(qiáng)行扯動紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。

(3) 當(dāng)出現(xiàn)堵孔時，按自動沖洗鍵沖洗管道。

 (4) 嚴(yán)格按照儀器的關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。

7. 期間核查

(1)PE-5700基因擴(kuò)增儀的定標(biāo)不需要特別的周期間隔，本實(shí)驗室PE-5700基因擴(kuò)增儀執(zhí)行衛(wèi)生部臨床檢驗中心的指定校準(zhǔn)。

(2) 校準(zhǔn)物均為與ICSH之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。

8. 相關(guān)記錄

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀 器 設(shè) 備 總 表

移液器操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：確保移液的精確性，正確使用移液器。

2．適用范圍：本實(shí)驗室使用的可調(diào)式移液器。

3．負(fù)責(zé)人：        操作人：

4．程序：

4．1移液器的使用

4．1．1轉(zhuǎn)動旋鈕設(shè)定移液量，設(shè)定的移液量不可超出該移液器規(guī)定的范圍。

4．1．2 裝上配套的Tip。

4．1．3 前進(jìn)移液法

a） 將按鈕壓至第一停點(diǎn)位置；

b ）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側(cè)的所有液滴。

c） 輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。約1秒鐘后，繼續(xù)將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。待管嘴液體放干凈后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松開按鈕使之回到起點(diǎn)位置。需要時，可更換管嘴繼續(xù)移液操作。

4．1．4 倒退移液法：適用于高粘度液體及/或易起泡沫液體的移液。

a） 將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。

b）將移液管管嘴浸入試劑瓶液面下2~3mm深處，然后慢慢松開鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側(cè)的所有液滴。

c ）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。

d）遺留在管嘴時的液體或者隨管嘴一起扔掉，或者放回原來的容器中。

4．1．5 重復(fù)操作法：重復(fù)操作移液法可以快速、簡便地重復(fù)轉(zhuǎn)移同體積的同種液體。

a）將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。待放完所需體積液體后，把按鈕停在第一停點(diǎn)位置，不包括在移液量之內(nèi)的少量液體仍留在管嘴內(nèi)，管嘴外的液滴則需包括在移液量之內(nèi)。

d ）將管嘴浸入試劑液面下不遠(yuǎn)處，然后慢慢松開按鈕使管嘴重新吸入液體。

e）重復(fù)步序c）和d ）繼續(xù)移液操作，就可重復(fù)轉(zhuǎn)移相同體積液體。

4．2  移液器的維護(hù)

每天對使用過的移液器用75%酒精進(jìn)行擦拭。每周1次對移液器咀進(jìn)行75%酒精浸泡15分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應(yīng)隨時浸泡處理。

4．3移液器的校準(zhǔn)

為確保移液器加樣的精確性和準(zhǔn)確性，正確使用移液器，需定期（一年）對移液器進(jìn)行校準(zhǔn)

4．3．1 校準(zhǔn)環(huán)境和用具要求

室溫：20～25℃，測定中波動范圍不大于±0.5℃。

電子天平：放置于無塵和震動影響的臺面上，房間盡可能有空調(diào)。稱量時，為保證天平內(nèi)的濕度（相對濕度60～90%），天平內(nèi)應(yīng)放置一裝有10mL蒸餾水的小燒杯。

小燒杯：5～10mL體積。

測定液體：溫度為20～25℃的去氣雙蒸水。

選定校準(zhǔn)體積：

a）擬校準(zhǔn)體積；

b）移液器標(biāo)定體積的中間體積。

c）最小可調(diào)體積（不小于擬定體積的10%）。

如為固定體積移液器，則只有一種校準(zhǔn)體積。

4．3．2 校準(zhǔn)步驟

a）將移液器調(diào)至擬校準(zhǔn)體積，選擇合適的吸頭；

b）調(diào)節(jié)好天平；

c）來回吸吹蒸餾水3次，以使吸頭濕潤，用紗布拭干吸頭；

d）垂直握住移液器，將吸頭浸入液面2～3mm，緩慢（1～3秒）一致地吸取蒸餾水

e）將吸頭離開液面，靠在管壁，去掉吸頭外部的液體；

f）將移液器以30℃角放入稱量燒杯中，緩慢一致地將移液器壓至第一檔，等待1～3秒，再壓至第二檔，使吸頭里的液體完全排出；

g）記錄稱量值；

h）擦干吸頭外面；

i）按上步驟稱量10次；

j）取10次測量值的均值作為最后移液器吸取的蒸餾水重量，按表1所列蒸餾水Z因子計算體積；

k）按校準(zhǔn)結(jié)果調(diào)節(jié)移液器。

4．3．3 比較校準(zhǔn)法

利用經(jīng)計量局校準(zhǔn)并頒發(fā)校準(zhǔn)報告之同型號移液器，在移液器量程范圍的高低兩個檔各選擇一個校準(zhǔn)點(diǎn)，利用電子天平稱量結(jié)果與已校準(zhǔn)移液器稱量結(jié)果進(jìn)行比較，完成校準(zhǔn)。

備注：連續(xù)可調(diào)移液器校準(zhǔn)由本市標(biāo)準(zhǔn)計量局統(tǒng)一校準(zhǔn)。

（表1  蒸餾水Z因子 hPa(mbar)）

5. 相關(guān)記錄

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀 器 設(shè) 備 總 表

沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測

1．  目的：保證CT DNA檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2．  適用范圍：CT DNA的TaqMan熒光定量檢測，標(biāo)本類型為分泌物。

3．  負(fù)責(zé)人：     操作人：

4．  原理：本試劑盒用一對沙眼衣原體特異引物和一條沙眼衣原體特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，再用PCR體外擴(kuò)增法檢測沙眼衣原體DNA。

5．  性能參數(shù)：檢出低值＜25基因拷貝/ml。

6． 標(biāo)本要求：

（1）標(biāo)本類型：分泌物。

（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊。

（3）標(biāo)本儲存和運(yùn)輸：室溫放置不超過8小時，4-8℃不超過72小時，-20℃保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運(yùn)輸。

（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染標(biāo)本不能作測定。

7． 容器和添加劑類型：無菌離心管和無菌試管。

8．  所需設(shè)備：ABI GeneAmp 5700、臺式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外燈

9．  試劑：DNA提取液（500μl/管）2管；CT-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1×10⁸基因拷貝/ml）（50μl/管）1管；陰性質(zhì)控品（250μl/管）1管。

10．   校準(zhǔn)程序（計量學(xué)溯源性）：送XXX市計量檢測所校準(zhǔn)。

11．   程序步驟:：

11.1標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送

男性：取尿道分泌物或細(xì)小棉拭子伸入快尿道約2~4cm，略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將分泌物或棉拭子置入無菌玻璃管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋�緊后，密閉送檢。

女性：陰道—用無菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒鐘后旋動棉拭采取宮頸分泌物，將棉拭子置入無菌玻璃管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋�緊后，密閉送檢。

尿道—用無菌生理鹽水棉球洗凈尿道口，再用無菌棉拭子插入尿道約2cm，略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將棉拭子置入無菌玻璃管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋�緊后，密閉送檢。

標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-20℃待測，保存期為6個月。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。

11.2標(biāo)本及對照標(biāo)準(zhǔn)品的處理

標(biāo)本試管中加入1ml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中（如分泌物較多，只取0.2ml）12000rpm離心5分鐘.沉淀加無菌生理鹽水1ml打勻,12000rpm離心5分鐘,再重復(fù)洗滌一次.沉淀直接加50ulDNA提取液充分混勻, (提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì),取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。) 沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），轉(zhuǎn)至4℃靜置6-8小時以保證充分裂解。12，000rpm離心2分鐘，取上清液2ul做PCR反應(yīng)。另取陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品各50ul加等量DNA提取液打勻，沸水浴10分鐘后同上處理。

11.3GeneAmp5700操作

取單管單人份PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后樣品（或陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品）2ul，6000rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：

ABI GeneAmp5700的循環(huán)條件：93℃  2分鐘預(yù)變性，然后按93℃45秒  55℃60秒，先做10個循環(huán)，最后93℃30秒  55℃45秒，做30個循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。

11.4結(jié)果分析條件的設(shè)定

ABI GeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使陰性質(zhì)控品Ct值為30,臨界陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為22~24, 強(qiáng)陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為18~20,最后記錄儀器自動分析計算出的Ct值.

12．   質(zhì)量控制程序：

陰性質(zhì)控品：全部陰性

陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽性

︱r︱≧0.97(correlation 數(shù)值介于-0.97~-1); 10⁸至10⁴基因拷貝/ml的陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測的定量值與理論值相比誤差小于±300%。

13．   干擾：標(biāo)本污染。

14．    生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或0基因拷貝/ml。

15．    患者檢驗結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值<40，實(shí)驗樣本的CT DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）=M；Ct值=40，樣品 CT DNA含量<25基因拷貝/ml。

16．   警告/危急值（當(dāng)適用時）：

17．   實(shí)驗室解釋：為沙眼衣原體感染的輔助診斷以及治療提供分子生物學(xué)上的參考依據(jù)。

18．   其它：《沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒說明書》見試劑盒

乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測

1． 目的：保證HBV DNA檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2． 適用范圍：HBV DNA的TaqMan熒光定量檢測，標(biāo)本類型為血清。

3． 負(fù)責(zé)人：        操作人：

4． 原理：本試劑盒用一對乙型肝炎病毒特異引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，再用PCR體外擴(kuò)增法檢測丙型肝炎病毒cDNA。

5． 性能參數(shù)：檢出低值＜1×10³基因拷貝/ml。

6． 標(biāo)本要求：

（1）標(biāo)本類型：血清。

（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊。

（3）標(biāo)本儲存和運(yùn)輸：室溫放置不超過8小時，4-8℃不超過72小時，-20℃保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運(yùn)輸。

（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能作測定。

7． 容器和添加劑類型：無菌離心管和無菌真空管

8． 所需設(shè)備：ABI GeneAmp 5700、臺式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外燈

9． 試劑：DNA提取液（500μl/管）2管；HBV-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1×10⁸基因拷貝/ml）（50μl/管）1管；陰性質(zhì)控品（250μl/管）1管。

10．             校準(zhǔn)程序（計量學(xué)溯源性）：送深圳市計量檢測所校準(zhǔn)。

11．             程序步驟:：

11.1標(biāo)本處理：取血清標(biāo)本40μl，加等量DNA提取液打勻。（提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。）沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），（為保證病毒顆粒充分裂解可轉(zhuǎn)至4℃靜置8~12小時）。10000rpm離心5分鐘，取上清2μl做PCR反應(yīng)。

11.2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋和處理：將陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1×10⁸基因拷貝/ml）6000rpm離心數(shù)秒標(biāo)示為10⁸，另取4支滅菌新0.5ml離心管，分別加入45μl陰性質(zhì)控品，依次標(biāo)示為10^7~10⁴。吸取10⁸管5μl至10⁷管，用加樣器反復(fù)混勻后換新吸頭取5μl至10⁶管，依次方法稀釋至10⁴管。-20℃保存；分別吸取稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度和陰性質(zhì)控品管各40μl，加等量DNA提取液打勻，以下步驟同上處理。

11.3PCR擴(kuò)增：取HBV-PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后的樣品管或陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品2μl，6000rpm離心1分鐘。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品梯度以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱，標(biāo)記熒光基團(tuán)種類和循環(huán)條件：ABI GeneAmp 5700的循環(huán)條件：93℃→2分鐘預(yù)變性，然后按93℃45秒→55℃60秒，先做10個循環(huán)，最后按93℃30秒→55℃45秒，做30個循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。

11.4結(jié)果分析條件的設(shè)定：ABI GeneAmp 5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖象調(diào)節(jié)baseline的start值（2~4），stop值（7~9）以及Threshold值，使Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到最佳（correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間，correlation數(shù)值等同于|r|），最后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標(biāo)本數(shù)值（Qty）。

12．             質(zhì)量控制程序：

陰性質(zhì)控品：全部陰性

陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽性

︱r︱≧0.97(correlation 數(shù)值介于-0.97~-1); 10⁸至10⁴基因拷貝/ml的陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測的定量值與理論值相比誤差小于±300%。

13．             干擾（如乳糜血、溶血、膽紅素血）和交叉反應(yīng)：乳糜血、溶血、膽紅素血基本不影響本實(shí)驗的測定。

14．             生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或0基因拷貝/ml。

15．             患者檢驗結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值<40，實(shí)驗樣本的HBV DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）=M；Ct值=40，樣品 HBV DNA含量<1 ×10³基因拷貝/ml。

16．             警告/危急值（當(dāng)適用時）：

17．             實(shí)驗室解釋：為乙型肝炎感染的輔助診斷以及治療提供分子生物學(xué)上的參考依據(jù)。

18．             其它：《乙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒說明書》見試劑盒

丙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測

1． 目的：保證HCV DNA檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2． 適用范圍：HCV DNA的TaqMan熒光定量檢測，標(biāo)本類型為血清。

3． 負(fù)責(zé)人：        操作人：

4． 原理：本試劑盒用一對丙型肝炎病毒特異引物和一條丙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以逆轉(zhuǎn)錄液，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用PCR體外擴(kuò)增法檢測丙型肝炎病毒cDNA。

5． 性能參數(shù)：檢出低值＜1×10³基因拷貝/ml。

6． 標(biāo)本要求：

（1）標(biāo)本類型：血清。

（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊。

（3）標(biāo)本儲存和運(yùn)輸：室溫放置不超過2小時，4-8℃不超過72小時，-20℃保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融，室溫運(yùn)輸。

（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能作測定。

7． 容器和添加劑類型：無菌離心管和無菌真空管。

8． 所需設(shè)備：ABI GeneAmp 5700、臺式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外燈。

9． 試劑：DNA提取液（500μl/管）2管；HCV-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1×10⁸基因拷貝/ml）（50μl/管）1管；陰性質(zhì)控品（250μl/管）1管。

10．             校準(zhǔn)程序（計量學(xué)溯源性）：

11．             程序步驟:：

11.1標(biāo)本采集和運(yùn)送

用無菌注射器抽取受檢者靜脈血1ml，注入無菌1.5ml離心管,于室溫靜置2小時,轉(zhuǎn)至4℃靜置1小時。8000rpm離心5分鐘，吸取200ul血清(注意勿帶入紅細(xì)胞)轉(zhuǎn)入另一無菌1.5ml離心管，即為血清標(biāo)本。標(biāo)本可立即用于測試（48小時以內(nèi)），也可保存于-20℃待測，保存期為6個月。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。

11.2標(biāo)本及對照標(biāo)準(zhǔn)品的處理

     向一新的經(jīng)高壓滅菌處理過的0.5ml離心管中加入10ul充分混勻的RNA提取液(RNA 提取液A易沉淀,取樣前需用移液器反復(fù)吸打混勻后吸取)。加入50ul血清或陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，再加入200ul的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘，6000rpm，離心1分鐘，小心吸去上清，用75%的預(yù)冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。（取75%乙醇400ul洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75%的乙醇400ul重復(fù)同上處理），65℃干燥沉淀10分鐘。（注：75%的乙醇配制時須用試劑盒中提供的DEPC H₂O）。

11.3逆轉(zhuǎn)錄

向沉淀管加入18ul HCV反應(yīng)液I以及逆轉(zhuǎn)錄酶系2ul，震蕩均勻，瞬間（3秒）離心后37℃放置45分鐘，95℃加熱3分鐘。瞬間（3秒）離心后，吸取5ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做PCR反應(yīng)。

11.4PCR擴(kuò)增及DA-620儀器熒光檢測操作

取單管單人份PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后樣品（或陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品）2ul，6000rpm離心數(shù)秒。將各后應(yīng)管放入PCR儀器的孔反應(yīng)槽內(nèi)，在電腦上按對應(yīng)順序設(shè)置陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)類和循環(huán)條件：

ABI GeneAmp5700的循環(huán)條件：93℃  2   分鐘預(yù)變性，然后按93℃45秒  55℃60秒，先做10個循環(huán)，最后93℃30秒  55℃45秒，做30個循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。

11.5結(jié)果分析條件的設(shè)定

ABI GeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使陰性質(zhì)控品Ct值為30,臨界陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為22~24, 強(qiáng)陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為18~20,最后記錄儀器自動分析計算出的Ct值.

12. 質(zhì)量控制程序：

13. 干擾（如乳糜血、溶血、膽紅素血）和交叉反應(yīng)：乳糜血、溶血、膽紅素血基本不影響本實(shí)驗的測定。

14. 生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或0基因拷貝/ml。

15. 患者檢驗結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值<40，實(shí)驗樣本的HCV DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）=M；Ct值=40，樣品 HCV DNA含量<1 ×10³基因拷貝/ml。

16. 警告/危急值（當(dāng)適用時）：

17. 實(shí)驗室解釋：為丙型肝炎感染的輔助診斷以及治療提供分子生物學(xué)上的參考依據(jù)。

18. 其它：《丙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒說明書》見試劑盒

結(jié)核桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測

1． 目的：保證TB DNA檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2． 適用范圍：TB DNA的TaqMan熒光定量檢測，標(biāo)本類型為血清。

3． 負(fù)責(zé)人：      操作人：  

4． 原理：本試劑盒用一對結(jié)核桿菌特異引物和一條結(jié)核桿菌特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，再用PCR體外擴(kuò)增法檢測結(jié)核桿菌DNA。

5． 性能參數(shù)：檢出低值＜1×10³基因拷貝/ml。

6． 標(biāo)本要求：

（1）標(biāo)本類型：血清。

（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊。

（3）標(biāo)本儲存和運(yùn)輸：室溫放置不超過8小時，4-8℃不超過72小時，-20℃保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運(yùn)輸。

（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能作測定。

7． 容器和添加劑類型：無菌離心管和無菌真空管。

8． 所需設(shè)備：ABI GeneAmp 5700、臺式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外燈

9． 試劑：DNA提取液（500μl/管）2管；TB-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1×10⁸基因拷貝/ml）（50μl/管）1管；陰性質(zhì)控品（250μl/管）1管。

10．             校準(zhǔn)程序（計量學(xué)溯源性）：送深圳市計量檢測所校準(zhǔn)。

11．             程序步驟:：

11.1標(biāo)本處理：標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送     

用無菌5ml玻璃管取受檢者肺深部咳出痰液1~3ml，密閉，即為標(biāo)本�；蛑苯映槿⊥庵苎�2ml（抗凝）。標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-20℃待測，保存期為六個月。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。

11.2標(biāo)本及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的處理

痰液中加入4倍體積的4%NaOH室溫放置10分鐘后15000rpm離心5分鐘。去上清，沉淀加無菌生理鹽水1ml打勻，15000rpm離心5分鐘；再重復(fù)洗滌一次。（知液標(biāo)本直用淋巴細(xì)胞分離液分離沉淀）沉淀直接加50ulDNA提取液充分混勻,(提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì),取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。)沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），轉(zhuǎn)至4℃靜置6-8小時以保證充分裂解。10，000rpm離心5分鐘，取上清液2ul做PCR反應(yīng)。另取陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品各40ul加等量DNA提取液打勻，沸水浴10分鐘后同上處理。

11.3PCR擴(kuò)增及DA-620儀器熒光檢測操作

取單管人份PCR反應(yīng)管一管，直接加入處理后樣品或陰陽性質(zhì)控品2ul，6000rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：

93℃  2分鐘預(yù)變性,然后按93℃45秒  55℃120秒,反應(yīng)10個循環(huán)后置33℃保溫,迅速逐個將反應(yīng)管放入熒光檢測儀,讀取并記錄讀當(dāng)數(shù)A₀。熒光激發(fā)波長為487nm，檢測波長為525nm。最后按93℃45秒  55℃120秒，共做30個循環(huán)后置33℃保溫。使用PE9600，9700，2400儀器循環(huán)參數(shù)為93℃30秒  55℃60秒，其它儀器循環(huán)參數(shù)為93℃45秒  55℃120秒。

PCR反應(yīng)后熒光檢測，待各PCR管充分冷卻至33℃后，迅速逐個將擴(kuò)增后的反應(yīng)管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀數(shù)A₁。熒光激發(fā)波長為487nm，檢測波長為525nm。

11.4 ABI GeneAmp5700操作

將各后應(yīng)管放入PCR儀器的孔反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)類和循環(huán)條件：

ABI GeneAmp5700的循環(huán)條件：93℃  2分鐘預(yù)變性，然后按93℃45秒  55℃60秒，先做10個循環(huán)，最后93℃30秒  55℃45秒，做30個循環(huán)。

11.5結(jié)果分析條件的設(shè)定

ABI GeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使陰性質(zhì)控品Ct值為30,臨界陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為22~24,強(qiáng)陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為18~20,最后記錄儀器自動分析計算出的Ct值.

12．             質(zhì)量控制程序：

陰性質(zhì)控品：全部陰性

陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽性

︱r︱≧0.97(correlation 數(shù)值介于-0.97~-1); 10⁸至10⁴基因拷貝/ml的陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測的定量值與理論值相比誤差小于±300%。

13．             干擾（如乳糜血、溶血、膽紅素血）和交叉反應(yīng)：乳糜血、溶血、膽紅素血基本不影響本實(shí)驗的測定。

14．             生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或0基因拷貝/ml。

15．             患者檢驗結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值<40，實(shí)驗樣本的TB DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）=M；Ct值=40，樣品 TB DNA含量<1 ×10³基因拷貝/ml。

16．             警告/危急值（當(dāng)適用時）：

17．             實(shí)驗室解釋：為結(jié)核桿菌感染的輔助診斷以及治療提供分子生物學(xué)上的參考依據(jù)。

18．             其它：《結(jié)核分支桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒說明書》見試劑盒

高速冷凍離心機(jī)使用、維護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1．目的：保證高速冷凍離心機(jī)的正常使用。

2．適用范圍：適用于本室使用的高速冷凍離心機(jī)。

3．負(fù)責(zé)人：       操作人：

4. 性能參數(shù):見說明書。

5．程序：

5．1 離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅固的地板或平臺上，并力求使儀器處于水平位置以免離心時造成儀器振蕩。

5．2 打開電源開關(guān)，將預(yù)先平衡好的樣品對稱放置于轉(zhuǎn)頭的樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。

5．3 旋動定時旋鈕設(shè)定離心時間，緩慢旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕使儀器轉(zhuǎn)速達(dá)到預(yù)定要求。

5．4 離心完畢后，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零位，關(guān)閉電源開關(guān)。

5．5 待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動時打開機(jī)蓋，取出離心樣品，再次關(guān)閉機(jī)蓋結(jié)束離心。

5．6 離心室的清潔：為了避免樣本等殘留物的污染，應(yīng)經(jīng)常對離心機(jī)外殼和離心室進(jìn)行清潔處理。對離心室清潔，應(yīng)先打開離心機(jī)蓋，撥掉電源線，用專用設(shè)備將離心機(jī)轉(zhuǎn)子旋下，再用中性去污劑（70%的異丙醇/水混合物或乙醇去污染）清潔離心室；離心室內(nèi)的橡膠密封圈經(jīng)去污劑處理后，用水沖洗，再用甘油潤滑。

5．7 轉(zhuǎn)子的清潔：轉(zhuǎn)子會被樣本殘留物污染，也可能會被某些化學(xué)試劑腐蝕，因此應(yīng)對轉(zhuǎn)子每月進(jìn)行清潔維護(hù)。每月用中性的清潔劑清潔轉(zhuǎn)子一次，并在儀器維護(hù)記錄本上作好記錄，以延長轉(zhuǎn)子的壽命。

6. 儀器維護(hù)

(1) 為確保安全和離心效果,儀器必須放置在堅固水平的臺面上,塑料蓋門上不得放置任何物品,樣品必須對稱放置,并在開機(jī)前確保已擰緊螺母。

(2) 應(yīng)經(jīng)常檢查轉(zhuǎn)頭及試驗用的離心管是否有裂紋,老化等現(xiàn)象,如有須及時更換.

(3) 試驗完畢后,需將儀器擦拭干凈,以防腐蝕.

(4) 如樣品比重超過1.2g/cm³,最高轉(zhuǎn)速n按下式計算:n=nmax*√--1.2/樣呂比重.

(5) 當(dāng)電機(jī)碳刷長度小于6mm時,必須及時更換.

(6) 在離心機(jī)未停穩(wěn)時不得開蓋.

(7) 儀器必須有可靠接地.

(8) 實(shí)驗結(jié)束后,請關(guān)閉后面的電源開關(guān),撥掉電源插頭時,請不要忘了打開后面的電源開關(guān).

(9) 該儀器在日常使用中請注意符合“5.6,5.7”要求。

      (10) 嚴(yán)格按照儀器的開關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。

7. 期間核查

(1)本儀器不需要特別的周期間隔。

(2) 校準(zhǔn)物均為與ICSH之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。

8. 相關(guān)記錄

儀器使用登記表

儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表

儀器設(shè)備檢定周期表

儀器設(shè)備維修申請表

儀器報廢（停用）單

儀器設(shè)備使用授權(quán)表

儀器設(shè)備檔案卡

儀器設(shè)備領(lǐng)（借）用登記表

儀器設(shè)備總表

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